pdf.php@id=6179

вают несколько раз, втягивая и выпуская жидкость из пипетки. Набирают в пипетку 1 мл смеси из одной пробирки, переносят ее во 2-ю, перемешивают аналогичным образом; из 2-й таким же образом в 3-ю и т.д. до 9-й пробирки, из 9-й пробирки после перемешивания 1 мл смеси выливают. В каждой последующей пробирке, таким образом, содержание фермента вдвое меньше, чем в предыдущей.

Во все 9 пробирок приливают по 1 мл воды и по 2 мл 0,5%- ного раствора крахмала. Перемешивают, встряхивают пробирки и помещают в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Через 30 мин пробирки вынимают, охлаждают их водопроводной водой, во все добавляют по 1 капле раствора йода, перемешивают и отмечают окраску.

Указания к составлению отчета Данные занести в табл. 4.

Активность амилазы определяют по формуле

Х = 2 · А,

где Х – активность амилазы в расчете на 1 мл слюны; А – разведение слюны в последней пробирке с желтоватой окраской.

71

Лабораторная работа № 14 Изучение кинетических свойств ферментов

Цель работы – научиться применять знания о строении, свойствах и механизмах действия ферментов и приобрести навыки исследования ферментов.

Теоретические сведения Кинетика ферментативных реакций – это раздел энзимоло-

гии, который изучает зависимость скорости реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ и от условий их взаимодействия. Изучение кинетики ферментативных реакций показывает их отличия от неорганических катализаторов.

Ферменты отличаются от химических катализаторов свойством термолабильности. Несмотря на то что увеличение температуры усиливает катализ, при высоких значениях температуры происходит денатурация белка и инактивация фермента. Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом. У животных этот оптимум лежит между 40 и 50 оС, у растений – между 50 и 60 оС. Однако есть отклонения, например, папаин наиболее активен при 80 оС, а каталаза – при 4 оС.

Активность ферментов зависит от рН среды. Большинство ферментов имеет максимальную активность в нейтральной среде, так как при других значениях рН изменяется степень ионизации аминокислотных радикалов. В резкокислой (пепсин – рН = 1,5–2,5) или резкощелочной (трипсин – рН = 7,8, аргиназа – рН= 9,5–9,9) средехорошоработаютлишьнекоторыеферменты.

Действие большинства ферментов высоко специфично. Для ферментов характерны реакционная специфичность (к типам катализируемых реакций) и субстратная специфичность (к природе соединения). Высокоспецифичные ферменты катализируют расщепление только одного типа связи в субстратах опреде-

72

ленной структуры (абсолютная специфичность). Некоторые из этих ферментов отличаются стереохимической специфичностью, т.е. действуют только на один из пространственных изомеров. Среднеспецифичные ферменты обладают ограниченной реакционной специфичностью, но широкой субстратной специфичностью (относительная, или групповая, специфичность). Низкоспецифичные ферменты (с низкой реакционной и субстратной специфичностями) встречаются редко.

Ферменты подвержены влиянию активаторов и ингибиторов. К числу активаторов относятся ионы биогенных металлов и некоторые анионы. Активаторы усиливают каталитическое действие ферментов, в отличие от кофакторов их отсутствие не препятствует протеканию ферментативной реакции. Металлы-активаторы облегчают образование фермент-субстратного комплекса, способствуют присоединению кофермента к апоферменту, обеспечивают становлениечетвертичной структурыфермента.

Ингибиторы ферментов бывают двух основных типов: необратимые и обратимые. Необратимые ингибиторы связывают или разрушают функциональную группу молекулы фермента, необходимую для проявления его каталитической активности. Среди обратимых ингибиторов различают три типа:

1.Конкурентные ингибиторы конкурируют с субстратом за связывание с активным центром, но в отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению. По своему строению конкурентные ингибиторы обычно напоминают субстрат данного фермента. Благодаря такому сходству конкурентному ингибитору удается обмануть фермент и связаться с ним. Конкурентное ингибирование можно устранить или ослабить, просто повысив концентрацию субстрата.

2.Неконкурентные ингибиторы присоединяются к фер-

менту не в активном центре, где связывается субстрат, а совсем

вдругом месте, нарушая конформацию активного центра. Такое

73

ингибирование не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата.

3. Бесконкурентные ингибиторы присоединяются к фер-

мент-субстратному комплексу, препятствуя его распаду.

Исследуемый материал: слюна, разведенная в 3 раза, и сахараза, извлеченная из дрожжей (2 г дрожжей растереть в ступке с 10 мл воды, поставить в термостат при 37 °С на 10–15 мин, отцентрифугировать смесь при 3000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость слить и использовать в работе).

Реактивы:

1)1%-ный раствор крахмала;

2)0,2%-ный раствор крахмала на 0,1%-ном растворе NaCl;

3)10%-ный раствор NaOH;

4)1%-ный раствор CuSO4;

5)0,1%-ный раствор йода в 0,2%-ном йодиде калия (раствор Люголя);

6)2%-ный раствор сахарозы;

7)реактив Фелинга (готовят отдельно два раствора: раствор № 1: в мерной колбе на 100 мл растворяют 20 г сегнетовой соли и 15 г NaOH и доводят водой до метки; раствор № 2: в мерной колбе на 100 мл растворяют в воде 4 г сульфата меди (II)

идоводят водой до метки; перед употреблением смешивают равные объемы этих растворов);

8)1%-ный раствор NaCl;

9)фосфатный буфер с рН = 5,0; 5,8; 6,2; 6,6; 7,0; 7,4; 8,0; 8,4

(готовят раствор №1: 9,072 г KН2РО4 растворяют в 1 л воды; готовят раствор №2: 11,866 г Na2HPO4·2H2O растворяют в 1 л воды; растворы с определенным значением рН получают совместным смешиваниемрастворов№1 и№2 согласнотабл. 5).

Оборудование:

1)штатив с пробирками;

2)песчаная баня или спиртовка;

74

3)термостат на 38 °С;

4)стакан со льдом или снегом;

5)часы;

6)предметные стекла;

7)стеклянные палочки.

Таблица 5

Приготовление буферных растворов с определенным значением рН

Ход работы

1. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

Метод основан на оценке скорости гидролиза крахмала α-амилазой слюны в зависимости от температуры.

В пробирку помещают 5 капель слюны, кипятят 1–2 мин и остужают. В две другие пробирки помещают по 5 капель некипяченой слюны. Во все пробирки вносят по 10 капель крахмала и ставят первую и вторую пробирки в термостат при 38 °С, а третью – в стакан со льдом или снегом на 3 мин. Затем в каждую пробирку прибавляют по 1–2 капли раствора Люголя и сравнивают появляющуюся окраску.

Указания к составлению отчета Написать уравнение гидролиза крахмала под действием

α-амилазы. Сделать вывод о зависимости ферментативной реакции от температуры и причинах этой зависимости.

75

2. Специфичность действия амилазы и сахаразы

Метод основан на сравнительном изучении гидролиза α-амилазой и сахаразой разных субстратов, содержащих гликозидные связи, – крахмала и сахарозы. Гидролиз крахмала и сахарозы оценивают пробой Фелинга на восстанавливающие сахара (мальтозу и глюкозу). Проба Фелинга основана на способности углеводов в щелочной среде восстанавливать ион Cu2+, содержащийся в реактиве Фелинга в виде комплексного соединения с тартратами, дооксидамеди(I) красногоцвета, выпадающеговосадок.

Для выявления специфичности α-амилазы в одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую – 10 капель раствора сахарозы. В обе пробирки вносят по 5 капель разбавленной слюны, перемешивают встряхиванием и ставят в термостат при 38 °С на 10 мин. Затем в обе пробирки прибавляют по 1 мл реактива Фелинга и нагревают до кипения. Отмечают появление красного осадка в одной из пробирок.

Для выявления специфичности сахаразы в одну пробирку вносят 10 капель раствора крахмала, в другую – 10 капель раствора сахарозы. В обе пробирки вносят по 5 капель сахаразы, перемешивают встряхиванием и ставят в термостат при 38 °С на 10 мин. Затем в обе пробирки прибавляют по 1 мл реактива Фелинга и нагревают до кипения. Отмечают появление красного осадка в одной из пробирок.

Указания к составлению отчета Написать уравнения гидролиза сахарозы. Нарисовать схему

опыта по типу: фермент – субстрат – результат пробы с реактивом Фелинга. Сделатьвыводоспецифичностиизученныхферментов.

3. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны

Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала

под действием α-амилазы слюны до и после добавления ионов

Cl- и Cu2+.

Берут три пробирки и наливают по 5 капель разведенной слюны. В первую пробирку добавляют 10 капель дистиллиро-

76

ванной воды, во вторую – 10 капель 1%-ного раствора хлорида натрия, в третью – 10 капель 1%-ного раствора сульфата меди. Затем в каждую пробирку добавляют по 20 капель раствора крахмала. Содержимое перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 38 °С. Через 10 мин с содержимым каждой пробирки проделывают реакцию на крахмал, приливая по 1 капле раствора йода в йодиде калия.

Указания к составлению отчета Отметить появившееся в пробирках окрашивание и на ос-

новании этого сделать вывод о действии ионов как активаторов или ингибиторов амилазы.

4. Определение оптимума рН для максимальной активности амилазы

Метод основан на сравнительной оценке скорости гидролиза крахмала α-амилазой слюны в зависимости от рН.

Ферменты очень чувствительны к изменению кислотности среды, в которой они действуют. Можно считать, что для каждого фермента имеется определенная концентрация протонов, при которой он наиболее активен. Изменение кислотности среды в ту или иную сторону от оптимума рН вызывает понижение активности фермента.

В восемь пробирок вносят по 2 мл буферного раствора со-

ответственно с рН = 5,0; 5,8; 6,2; 6,6; 7,0; 7,4; 8,0; 8,4. Во все пробирки добавляют по 5 мл 0,2%-ного раствора крахмала (на 0,1%-ном растворе NaCl) и по 1 мл слюны, разбавленной в 3 раза. Пробы тщательно перемешивают (избегая образования пены!) и помещают в термостат (37 оС).

Через 3 мин из пятой пробирки отбирают 1 каплю раствора и наносят на предметное стекло, смешивая с 1 каплей раствора Люголя. Если образуется синее, фиолетовое или фиолетовокрасное окрашивание, реакцию с раствором Люголя повторяют через каждые 3 мин, пока окраска смеси не станет буро-красной.

Вэтот момент все пробы извлекают из термостата и добавляют

вних по 5 капель раствора Люголя, тщательно перемешивают.

77

В пробе с оптимальным значением рН, где скорость реакции была максимальной, раствор окрашивается в желтый цвет, что свидетельствует о полном расщеплении крахмала.

Указания к составлению отчета Результатыопыта представить в виде табл. 6. Сделать вывод о

зависимостискоростиферментативнойреакцииотрНсреды. Таблица 6

Определение оптимума рН для максимальной активности амилазы

Вопросы для самостоятельной работы

кразделу «Ферменты»

1.Каково строение ферментов?

2.Что такое активный центр фермента?

3.Сопоставьте ферментативный и неферментативный процессы. Как сказывается присутствие фермента: а) на изменении стандартной свободной энергии реакции; б) на энергии активации реакции; в) на начальной скорости реакции; г) на температурном коэффициенте константы скорости?

4.Перечислите особенности ферментативного катализа и этапы ферментативной реакции.

5.На чем основана классификация ферментов? Перечислите классы ферментов и их кодовые шифры. Заполните табл. 7.

78

6.Чем объяснить термолабильность ферментов? Каков температурный оптимум для действия ферментов живых организмов?

7.Чем обусловлено изменение активности фермента при изменении рН реакционной среды?

8.Что такое специфичность фермента и чем она обусловлена? Приведите пример фермента: а) с относительной специфичностью; б) с абсолютной специфичностью; в) со стереоспецифичностью.

9.Опишите количественный подход к оценке активности ферментов с применением уравнения Михаэлиса – Ментен и важнейших ферментативных параметров – константы Михаэлиса и каталитической константы.

10.Что такое ингибиторы? Назовите типы ингибирования. Приведите примеры.

11.Что такое активаторы? Приведите примеры активаторов. Какова роль ионов металлов в ферментативном катализе?

12.Как определить порядок ферментативной реакции по отношению к концентрации фермента?

13. Дайте определение иммобилизованным ферментам.

Вчем их преимущества? Назовите области их применения.

14.Как используются ферменты в биотехнологии и научных исследованиях? Приведите примеры.

79

Раздел VI. ОБМЕН ВЕЩЕСТВ

Метаболизм, или обмен веществ, – это совокупность всех химических реакций в организме, которые обеспечивают его веществами и энергией, необходимыми для жизнедеятельности.

Метаболический путь – это характер и последовательность химических превращений конкретного вещества в организме. Промежуточные продукты, образовавшиеся в процессе метаболизма, называются метаболитами, а последнее соединение метаболического пути – конечным продуктом.

Процесс распада сложных веществ на более простые называется катаболизмом. Так, поступающие с пищей белки, жиры, углеводы под действием ферментов пищеварительного тракта распадаются на более простые составные части (аминокислоты, жирные кислоты и моносахариды). При этом высвобождается энергия. Обратный процесс, т. е. синтез сложных соединений из более простых, называется анаболизмом. Он идет с затратой энергии. Из образовавшихся в результате пищеварения аминокислот, жирных кислот и моносахаридов в клетках синтезируются новые клеточныебелки, фосфолипидымембраниполисахариды.

Существует понятие «амфиболизм», когда одно соединение разрушается, но при этом синтезируется другое.

Биологическое окисление (тканевое дыхание) протекает во всех живых клетках организма в виде совокупных окислительных реакций. Основной функцией этого процесса является обеспечение организма энергией для процессов жизнедеятельности. Основной формой запасания энергии, доступной для использования, является аденозинтрифосфорная кислота (АТФ).

Процесс биологического окисления протекает многостадийно с участием промежуточных ферментативных реакций. Происходит многократная передача протонов и электронов или только электронов от донора к акцептору. Конечным акцептором электронов и протонов служит кислород. Конечными продуктами тканевого дыхания являются вода окисления и диоксид углерода (Н2О и СО2).

80