диссертации / 70

2.2.Описания материальной части отдельных исследований

2.2.1Исследование иммунотропных свойств типичных

представителей основных групп антибиотиков у пациентов, страдающих

хроническим обструктивным пиелонефритом, осложненным ХПН, in

vitro

В качестве основной группы были отобраны 25 пациентов, страдающих хроническим обструктивным пиелонефритом и имеющим снижение скорости клубочковой фильтрации (15-35 мл/мин), то есть II стадию хронической почечной недостаточности или IV стадию «хронической болезни почек», и получавших лечение в ФГБУ «НИИ урологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Причиной почечной недостаточности послужил хронический обструктивный пиелонефрит на фоне мочекаменной болезни. Контрольную группу составили 15

призывников, не имеющих соматических заболеваний, поступивших на обследование в городскую клиническую урологическую больницу №47

Департамента здравоохранения г. Москвы по поводу энуреза. Иммунологические исследования проводились на кафедре

молекулярной фармакологии и радиобиологии ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения Российской Федерации. Для оценки влияния антимикробной терапии на продукцию цитокинов клетками мононуклеарной фракцией было отобрано 5 антибактериальных препаратов,

являющиеся характерными представителями фармакологических групп -

фторхинолон II поколения ципрофлоксацин, цефалоспорин III поколения цефтриаксон, аминогликозид III поколения амикацин, карбапенем меропенем, гликопептид ванкомицин (рис. 1).

61

Рисунок 1. Схема исследования влияния антибактериальных препаратов на цитокинопродукцию мононуклеарной фракцией клеток периферической крови.

Выделение мононуклеарной фракции крови по методу Boyum (1968)

Все операции проводились в температурном режиме 0-40С. Для инкубации клеток мононуклеарной фракции периферической крови с антибактериальными препаратами исследуемые препараты вносили в лунки 96–луночного стерильного плоскодонного планшета (COSTAR) кроме контроля так, чтобы их конечная концентрация в инкубационной среде составила от 3 до 50 мкг/мл в соответствии с Сmax препаратов. Суспензию клеток (~1 млн/лунку) помещали в планшет и культивировали в стерильных условиях при 37ºС в условиях 5% СО2

в течение 72 часов с использованием ламинарбокса ЛБ-В (Россия). При культивировании клеток использовали стандартную среду RPMI-1640 с

добавлением 20 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл (НИИЭиМ им. Н.Ф.

Гамалеи). Для стимуляции пролиферации в каждую лунку вносили

62

фитогемагглютинин до конечной концентрации в инкубационной среде 1 мкг/мл. Конечный объем инкубационной среды составил 200 мкл. Количество и жизнеспособность клеток оценивали в камере Горяева в присутствии 0,1% раствора трипанового синего. По окончании инкубации для анализа уровня цитокинов иммуноферментным методом отбирали по 100 мкл инкубационной жидкости из каждой лунки. Все исследования проводились в триплетах. Иммуноферментный анализ проводили согласно инструкции, прилагаемой к наборам реагентов фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин-10,

интерлейкин-4, интерлейкин-1 бета («Вектор-БЕСТ», Россия). Регистрацию результатов проводили с помощью планшетного фотометра («Униплан» АИФР-

01, Россия), измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм.

2.2.2. Ретроспективный анализ скорости достижения ремиссии

хронического обструктивного пиелонефрита при использовании

ципрофлоксацина, цефтриаксона, меропенема

Для поиска клинических эквивалентов выявленных иммунологических феноменов был проведен ретроспективный анализ фармакотерапии 350 пациентов, страдавших обострением хронического обструктивного пиелонефрита на фоне мочекаменной болезни, проходивших лечение ФГБУ «НИИ урологии Минздравсоцразвития РФ» и городской клинической урологической больницы №47 Департамента здравоохранения г. Москвы за период 2010-2011гг. Пациенты были разделены на 3 группы согласно назначенному антибактериальному препарату. Выбор лекарственных препаратов для исследования осуществлялся по нескольким позициям:

широкое применение в реальной урологической практике;

высокая антиграмотрицательная активность;

доказанная эффективность для лечения неспецифических инфекционно-воспалительных заболеваний органов мочеполовой системы, в

том числе пиелонефрита (уровень доказательности А или B);

63

доступность (в том числе и экономическая) препарата на отечественном рынке.

Проанализировав фармакологические свойства, а также доказательные базы имеющихся на отечественном рынке антибактериальных препаратов,

мы пришли к выводу, что в наибольшей мере указанным требованиям отвечают:

из группы цефалоспоринов - цефтриаксон (115 пациентов);

из группы фторхинолонов – ципрофлоксацин (120 пациентов);

из группы карбапенемов – меропенем (115 пациентов).

Данные препараты широко применяются в реальной урологической практике в режиме монотерапии для лечения хронического пиелонефрита на фоне мочекаменной болезни.

Объектом изучения было время, прошедшее с момента начала антибактериальной терапии (эмпирической или согласно антибиотикограмме) до достижения ремиссии, под которой подразумевалось исчезновение клинических и лабораторных проявлений активности воспалительного процесса в почках – нормализация общего состояния больного, исчезновение отека почки по данным ультразвукового сканирования, лейкоцитоза, палочкоядерного сдвига лейкоцитарной формулы влево и других гематологических индикаторов активности воспалительного процесса, лейкоцитурии.

2.2.3. Исследование чувствительности основных возбудителей

пиелонефрита к тигециклину

Исследование чувствительности основных возбудителей пиелонефрита к тигециклину основано на результатах 1210 бактериологических анализов мочи, выполненных в ФГБУ «НИИ урологии Минздравсоцразвития РФ» за период октябрь 2010–июль 2011 гг. Биоматериал забирался у 965 пациентов,

страдающих хроническим пиелонефритом на фоне мочекаменной болезни, у

64

154 пациентов с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря, а также у 91 пациента с аномалиями развития органов мочеполовой системы.

Бактериологический анализ мочи с антибиотикограммой выполнялся с использованием полуавтоматического анализатора VIEMS Labsistems,

Финляндия.

2.2.4. Исследование иммунотропных свойств тигециклина у

пациентов, страдающих хроническим обструктивным пиелонефритом,

осложненным ХПН, in vitro

Висследование включено 43 пациента, в том числе 21 больной, страдающих хроническим обструктивным пиелонефритом, осложненным хронической почечной недостаточности II стадии (скорость клубочковой фильтрации 40-15 мл/мин по пробе Реберга) на фоне мочекаменной болезни. Клиническое обследование и лечение этих пациентов осуществлялось в стационаре НИИ урологии в 2012 г. Контрольную группу пациентов с нормальной функцией почек составили 22 призывника, не имеющих соматических заболеваний, поступивших на обследование в городскую клиническую урологическую больницу №47 Департамента здравоохранения г. Москвы по поводу энуреза.

Иммунологические исследования, в частности, выделение мононуклеарной фракции крови, иммуноферментный анализ, проводились на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии МБФ ГОУ ВПО РНИМУ.

Вкачестве параметров для оценки состояния цитокинопродукции мононуклеарной фракцией клеток периферической крови были выбраны ФНО-α и ИЛ-8 - цитокины, обладающие способностью соответственно усиливать и ослаблять воспалительные реакции (провоспалительный и противовоспалительный цитокины).

65

Выделение мононуклеарной фракции крови осуществлялось по методу

Boyum (1968).

Воздействие препарата на выживаемость (пролиферативную активность,

цитотоксичность) мононуклеарной фракции периферической крови определяли микроколориметрическим методом – МТТ-тестом, который проводился по окончании 48 часовой инкубации клеток с препаратом.

Метод основан на редукции тетразолевого кольца 3-(4,5-dimethylthiazol- 2yl)-2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide) MTT-дегидрогеназами митохондрий живых пролиферирующих клеток с образованием нерастворимых фиолетовых кристаллов формазана и является стандартным для оценки токсичности соединений в культуре. Раствор МТТ (концентрация 10 мг/мл в питательной среде) вносили по 10 мкл в лунки планшета с клетками. Среду удаляли через 2 часа инкубации, фиолетовые кристаллы формазана,

выпавшие на дне лунок, растворяли в лунках планшета диметилсульфоксидом и измеряли оптическую плотность на планшетном фотометре «Униплан» (Россия, «Пикон») при 530 нм.

Все исследования проводились в триплетах. Иммуноферментный анализ проводили согласно инструкции, прилагаемой к наборам реагентов ФНО-α,

ИЛ-8 («Вектор-БЕСТ», Россия). Регистрацию результатов проводили с помощью планшетного фотометра («Униплан» АИФР-01, Россия), измеряя оптическую плотность при длине волны 530 нм 2-3 раза по 5 мин.

2.2.5. Влияние тигециклина на экспрессию гена p53 в

мононуклеарах периферической крови у пациентов, страдающих

хроническим обструктивным пиелонефритом, осложненным ХПН

Выделение мРНК клеток мононуклеарной фракции периферической крови периферической крови проводили с помощью набора "Рибо-

преп""(AmpliSens) согласно инструкции производителя.

66

Получение кДНК на матрице мРНК проводили с использованием комплекта готовых реагентов "Реверта-L"(AmpliSens) согласно инстукции

производителя.

Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили с набором "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии

SYBR Green I"(Синтол) на приборе iCycler iQ5 real-time PCR (BioRad,

определения количества по формуле (1/2)∆Ct, где ∆Ct= Ct(p53)−Ct(GAPDH)

и формуле (1/2)^ΔΔCt.

67

Глава 3

Исследование иммунотропных свойств типичных представителей основных групп антибиотиков у пациентов, страдающих хроническим обструктивным пиелонефритом, осложненным ХПН, in vitro

Основными продуцентами ИЛ-1β являются макрофаги, Т и В клетки. У

пациентов с нормальной скоростью клубочковой фильтрации амикацин и ванкомицин стимулируют секрецию ИЛ-1β, в то время как меропенем ингибирует продукцию этого интерлейкина (рис. 2).

Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с ФГА (фитогемагглютинин) -

контролем.

Рисунок 2. Влияние антибактериальных препаратов на продукцию ИЛ-1β

клетками мононуклеарной фракции периферической крови при нормальной функции почек и в условиях хронического обструктивного пиелонефрита,

осложненного ХПН.

При хроническом обструктивном пиелонефрите, осложненном ХПН,

функциональная активность мононуклеарной фракции клеток периферической крови (цитокинопродукция) в целом значительно снижена по сравнению с лицами, имеющими нормальную функцию почек. В этих условиях

68

стимулирующее влияние на продукцию ИЛ-1β отмечено только у амикацина,

остальные препараты не вызвали значимых изменений.

Основными продуцентами ФНО-α являются макрофаги, Т- и В-клетки,

нейтрофилы. В исследовании активность нейтрофилов не учитывается, поэтому уровень суммарного цитокина плазмы может отличаться от полученных результатов. Продукцию ФНО-α у пациентов с нормальной скоростью клубочковой фильтрации достоверно снижают меропенем, ванкомицин и ципрофлоксацин. При хроническом обструктивном пиелонефрите,

осложненном ХПН, достоверного влияния исследуемых антибактериальных препаратов на продукцию этого цитокина выявлено не было (рис. 3).

Однако можно отметить, что при хронической почечной недостаточности не зависимо от присутствия антибактериальных препаратов продукция мононуклеарами ФНО-α страдает еще в большей степени, чем ИЛ-1β.

Примечание: * - р≤0,05 по сравнению с ФГА-контролем

Рисунок 3. Влияние антибактериальных препаратов на продукцию ФНО-α

клетками мононуклеарной фракции периферической крови при нормальной функции почек и в условиях хронического обструктивного пиелонефрита,

осложненного ХПН.

69

Таким образом, стимулированная продукция провоспалительных

цитокинов в в условиях хронического обструктивного пиелонефрита,

осложненного ХПН снижена.

ИЛ-10 синтезируется и секретируется макрофагами, Т-хелперами 2-го типа и В-клетками. Противовоспалительный эффект ИЛ-10 заключается в блокаде продукции провоспалительных цитокинов Т-хелперами 1-го типа.

У пациентов с нормальной функцией почек ванкомицин достоверно подавляет выработку ИЛ-10 мононуклеарами; в то время как ципрофлоксацин и амикацин стимулируют ее (р=0,048 и 0,052 соответственно). При хроническом обструктивном пиелонефрите, осложненном ХПН, продукцию этого интерлейкина стимулируют амикацин, меропенем и ципрофлоксацин (рис. 4).

Примечание: * р≤0,05 по сравнению с ФГА-контролем.

Рисунок 4. Влияние антибактериальных препаратов на продукцию ИЛ-10

клетками мононуклеарной фракции периферической крови при нормальной функции почек и в условиях хронического обструктивного пиелонефрита,

осложненного ХПН.

Основные продуценты ИЛ-4 тучные клетки и Т-хелперы 2-го типа. ИЛ-4

стимулирует активность тучных клеток, эозинофилов и антителопродукцию В-

70