диссертации / 35

иммунореактивного инсулина (ИРИ) натощак, после 12часового голода и через 2 часа после нагрузки 75 г глюкозы. Исследовалась сыворотка крови из локтевой вены иммуноферментным методом на автоанализаторе «Immulite one DPC», производство США. ИРИ определяли наборами реактивов «DPC»,

США. Нормальными считали значения ИРИ натощак менее 11,0 мкМЕ/мл,

ИРИ через 2 часа после нагрузки 75 г глюкозы - менее 20,0 мкМЕ/мл [9].

Инсулинорезистентность оценивалась при помощи модели оценки гомеостаза (Homeostasis Model Assessment) – НОМА-IR, которая вычисляется по формуле (Matthews D.R. et al., 1985) [20].

[Инсулин натощак (мкМЕ/мл) * глюкоза натощак (ммоль/л)] /

22,5.

Согласно рекомендациям ВОЗ, в клинической практике для оценки наличия ИР предложено использовать верхнюю квартиль распределения индекса HOMA-IR в общей популяции. Нормальными являлись значения

HOMA-IR менее 2,0.

Определение показателей липидного обмена

Показатели липидного спектра определяли после 12 часов голода по пробе крови из локтевой вены. Работы проводили на автоанализаторе

«Коnеlab j20» (Финляндия) наборами реактивов «Тhеrmо clinical labsystems».

Оценивали показатели липидного спектра по критериям EGIR 2002г.

Холестерин общий. ОХ определяли ферментативным энзиматическим калометрическим методом, реакцией СНОD-РАР.

Классификация ГХС:

ОХС Оптимальный < 5,0 ммоль/л

Умеренно повышенный> 5,0-5,9 ммоль/л;

Высокий > 6,0 ммоль/л;

Повышенными считали значения ≥ 6,1 ммоль/л (ВНОК,2009).

Холестерин липопротеидов высокой плотности. Значения

холестерина липопротеидов высокой плотности (XC ЛПВП) определяли

41

глюкозооксидантным методом, предварительно осаждая сыворотку крови хлористым магнием. При оценке нарушений липидного обмена в рамках диагностических критерий МС, пограничными значениями в соответствии с критериями EGIR считали уровень ХС ЛПВП более 1,0 ммоль/л [58].

Холестерин липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП).

Определение ХС ЛПНП производили расчетным методом по формуле Фридвальда (Friedwald W.T., 1972) [43]:

ХС ЛПНП = ОХ – ХС ЛПВП - ТГ/2,2 (ммоль/л),

ТГ – триглицериды, уровень которых не превышал 4.5 ммоль/л.

Нормальными считали значения ХС ЛПНП менее 3,0 ммоль/л.

Триглицериды. Уровень ТГ определяли ферментативным калометрическим методом, реакцией GРО-РАР. Пограничные уровни ТГ для взрослых составляют < 1,7 ммоль/л по критериям EGIR(2002).

Липопротеиды очень низкой плотности. Определение ЛПОНП производилось расчетным методом по формуле:

ЛПОНП = Триглицериды/2,2 (ммоль/л)

2,2 – коэффициент, полученный эмпирическим путем для расчета ЛПОНП.

Нормальными считали значения ЛПОНП менее 1,04 ммоль/л.

Определяли уровни аполипопротеинов А1 (Апо-А1) и В (Апо-В) с

расчетом аполипопротеинового индекса атерогенности по соотношению Апо-В/Апо-А1. Аполипопротеин А1 (АПО-1) и аполипопротеин В (АПО-В)

определяли в человеческой сыворотке иммунотурбидиметрическим методом.

Коэффициент атерогенности. Расчет коэффциента атерогенности

производился по формуле:

42

ультразвуковые методы позволяют достоверно диагностировать сосудистые поражения на ранних стадиях развития (McFarlane S.I. et al., 2001) [43].

При ультразвуковом исследовании у здорового человека комплекс интима-медиа представляет собой двухслойную структуру с прилежащим к просвету гиперэхогенным слоем и подлежащим гипоэхогенным. Измерение отдельно слоев интимы и медии с помощью современных инструментальных технологий невозможно. При утолщении комплекса интима-медиа (ТКИМ) в

атеросклерозом характеризуется изолированным изменением состояния комплекса интима-медиа артерий: утолщением, сопровождающимся изменением его эхоструктуры и эхогенности (повышением эхогенности,

снижением эхогенности, нарушением дифференцировки комплекса интима-

медиа на слои, неровностью поверхности, неоднородностью структуры), при этом степень сужения просвета сосуда по диаметру составляет не более 20%.

Для получения изображения сонной артерии и проведения измерений ее диаметра использовали систему VOLUSON 730 EXPERT 2006г., оснащенную линейным датчиком с фазированной решеткой с частотой 7,5 МГц. Глубина

(depth), усиление (gain), а также параметры логарифмической компенсации,

препроцессинга и пост-процессинга были индивидуально подобраны для

каждого пациента, и сохранялись неизменными в ходе исследования.

При продольном ультрасонографическом сканировании сонной

артерии, детально изучался отрезок длиной 1 см, примыкающий непосредственно к началу бифуркации. Измерение ТКИМ общих сонных артерий проводили в В-режиме по предложенной P.Pignoli методике (1986).

Исследование проводили утром (до 10 часов) натощак в положении больного на спине после 10 минутного отдыха в горизонтальном положении, голова несколько повернута в противоположную сторону с приподнятым подбородком. Исследовались правая и левая общие сонные артерии на

44

протяжении дистальной части ОСА, области бифуркации, проксимального участка ВСА в продольном и поперечном сечении. Стандартизованное измерение ТКИМ в общих сонных артериях проводилось в 3 точках на 1 см проксимальнее ее бифуркации по задней (по отношению к датчику) стенки артерии. При каждом исследовании использовались разные углы сканирования (передний и латерально-нижний), чтобы определить наибольшую ТКИМ, определяемую, как расстояние между границей просвет/интима и границей средний слой/адвентиция. Эти измерения ТКИМ проводились как на правой, так и на левой сонной артерии, затем вычислялась средняя величина для правой стороны, для левой стороны и для двух сторон вместе с учетом максимальной величины по 6 точкам справа и слева (Рис.3).

Рис.3. Определение ТКИМ ОСА при УЗДГ (Г.Е.Ройтберг,

А.В.Струтынский, 2005) [43].

Стенка артерии, расположенная ближе к датчику, называется ближней,

дальше от датчика - дальней. В изображении ближней стенки слой адвентиции, как более плотной структуры, перекрывает изображение линии раздела адвентиция-медиа и достоверно локализовать ее невозможно.

Верхний край второй эхо-линии соответствует поверхности раздела интима-

просвет артерии, но абсолютная величина этой структуры не соответствует анатомическим аналогам по ранее изложенной причине. В изображении дальней стенки, соответственно, изображение поверхности раздела просвет

45

артерии-интима будет соответствовать верхнему краю первого слоя,

величина которого не имеет анатомического аналога. Поверхность раздела медиа-адвентиция соответствует верхнему краю второго слоя и, таким образом, толщина комплекса интима-медиа может быть адекватно измерена как расстояние между верхними границами первого и второго слоев изображения. Невозможность адекватно оценить состояние ближней стенки,

обуславливает необходимость исследовать артерии в нескольких сечениях: 3

продольных (передне-заднем, латеральном, задне-латеральном) и

поперечном. Так достигается наиболее полный объем информации о состоянии артериальной стенки.

Диаметр сосуда определяют как расстояние между проксимальным и дистальным по отношению к датчику доплеровскими сигналами. Объемные показатели кровотока с помощью соответствующих формул рассчитываются исходя из диаметра артерий (площади сечения артерии - S=3D2p /4) и

скорости кровотока. В течение всего исследования датчик не смещается.

Диаметр сосуда оценивается строго в одном и том же месте.

В В-режиме и в режиме цветной доплеровской визуализации имеющиеся ограничения прибора в точности установки измерительных маркеров приводят к ошибке в оценке расстояний, равной около 0,25% от длины полномасштабного дисплея или зоны обзора.

Пороговые значения ТКИМ у мужчин и женщин составляли более 1,0

мм.

2.4.Молекулярно-генетическое исследование

Всем пациентам при включении в исследование было проведено молекулярно-генетическое тестирование на наличие полиморфизма трех позиций промоторного региона гена ФНО-α. Исследование, выполненное на базе генетической лаборатории ОАО «Медицина», включало три этапа:

-Выделение ДНК из клинического образца

-Амплификация специфических фрагментов ДНК

46

-Детекция продуктов амплифкации Для ДНК диагностики точковых мутаций и полиморфизмов

используется метод аллель специфичного лигирования с последующей амплификацией. К основным преимуществам данного метода относятся его чувствительность, возможность работать с небольшим количеством исследуемого материала, специфичность и простота исполнения.

В наборе предусмотрен один или несколько образцов ДНК для обязательного положительного контроля прохождения реакции. В случае отсутствия фрагментов амплификации в исследуемых образцах и наличия их в положительном контроле выделение ДНК из проб проводили заново.

Выделение ДНК из цельной венозной крови

ДНК выделяли по стандартной неэнзиматической методике с использованием коммерческого набора реагентов DiatomTM DNA Prep 100 (ООО «Центр молекулярной генетики», Россия) из лимфоцитов

периферической крови, взятой из локтевой вены [173]. Выделенную ДНК

замораживали и хранили при –20 °С. Изучение полиморфных вариантов исследуемых генов проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя

структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе.

Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови следующим образом. Однородный образец крови (50 мкл) помещали в пробирку «Эппендорф» с 1000 мкл деинизированной воды и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 10 000g и ресуспендировали, оставляя осадок и около 30 мкл надосадочной жидкости. К осадку добавляли до 200 мкл 5%

раствора смолы Chelex-100 (BioRad) и в течение нескольких секунд перемешивали на микроцентрифуге Vortex.

Полученный материал инкубировали при t=560С в течение 30 минут.

Повторно перемешивали на микроцентрифуге Vortex и инкубировали при

47

t=1000С в течение 8 минут. После инкубации производили интенсивное встряхивание на Vortex и центрифугировали 3 минуты с ускорением 10

000g. Для проведения ПЦР брали надосадочную жидкость.

Амплификация.

Для амплификации ДНК-фрагмента длиной 148 нуклеотидных проб с вариабельным нуклеотидом в 308 положении промоторного региона использовали следующие праймеры: 5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT- 3' и 5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3', синтезированные для исследования фирмой ЗАО "Синтол". Геномную ДНК (~ 100 нг) аплифицировали,

используя 1,25 ед. Таg-полимеразы (Fermentas) в 25 мкл буфера,

содержащего 75 мМ Трис-HCl (pH 8.8), 20 мM (NH4)2SO4, 0.01% Tween 20,

2,5 мM MgCl2, 2 мM каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP) и 0,2 мкМ каждого праймера. ПЦР проводили на амплификаторе Hybaid PCR Express

при следующих условиях амплификации:

Шаг 1. - 940С – 2 мин,

Шаг 2 - 940С – 20 сек,

Шаг 3 - 550С – 30 сек,

Шаг 4 - 720С – 35 сек.

Шаги 2,3 и 4 повторяли 30 раз. Шаг 5 - 720С – 2 мин.

амплификата инкубировалось при t=370C 4 часа в присутствии 5 ед. NcoI

(рис. 1).

Фрагменты рестрикции анализировали методом горизонтального электрофореза в 7 % акриламидном геле (сток-раствор АА/БА 29:1).

Электрофоретическое разделение фрагментов проводили при напряженности поля 16 В/см в течение часа. В качестве контроля вместе с

48

исследуемыми образцами наносили образцы, которые не подвергались ферментативной обработке.

Аллель ФНО- α 308 (G) давал 2 фрагмента длиной 128 и 20

нуклеотидных пар, аллель ФНО- α 308 (A) - один фрагмент – 148 н.п. Таким образом, гомозиготы по аллелю ФНО- α 308 (GG) давали два фрагмента, в то время как гомозиготы по аллелю ФНО- α 308 (AA) давали один фрагмент, а

гетерозиготы (GA) – 3 фрагмента.

Анализ полученных результатов

Длина амплифицируемого фрагмента - 148 п.н.

После проведения рестрикции на геле регистрируются полосы (рис. 4):

вслучае аллеля G – 128+20 п.н.

вслучае аллеля A – 148 п.н.

Электрофореграмма результатов амлификации с последующей рестрикцией:

148 п.н.

128 п.н.

Рис. 4. Образец до рестрикции

Маркер молекулярного веса ДНК фага λ, рестрицированная PstI

генотип A/G

генотип A/G

генотип A/G

генотип G/G

генотип G/G

Контрольная ДНК – A/G

49

2.5. Статистические методы

Результаты исследования обрабатывались на персональном компьютере с помощью стандартного пакета программ для обработки статистической информации «SPSS 11.00», что позволило проводить проверку различных гипотез. Обработка полученных материалов проведена с использованием стандартных статистических и математических методов:

одномерный статистический анализ, оценка частоты встречаемости признаков в изучаемой совокупности проводили методом 2, сравнение количественных показателей (оценка достоверности по t-критерию Стьюдента). Количественные показатели были описаны в терминах среднего значения стандартного отклонения (дисперсии) и стандартной ошибки среднего. При сравнении средних значений в изучаемых различных группах использовался метод дисперсного анализа. Результаты расценивались как значимые при уровне вероятности р<0,05.

Соответствие распределения аллелей и генотипов равновесию Харди-

Вайнберга проверяли по критерию χ ².

Сумма частот трех генотипов, представленных в изучаемой группе,

равна 1.

p - частота G аллеля;

q - частота A аллеля;

p2 - гомозиготный GG генотип;

2pq - гетерозиготный GA генотип;

q2 - гомозиготный AA генотип,

для частот аллелей: p + q = 1;

для частот генотипов: p2 + 2pq + q2 = 1.

С помощью метода Каплана-Мейера был проведен анализ вероятности развития атеросклероза, артериальной гипертензии и клинически значимых

50