диссертации / 21

митохондрий и высвобождающими кальций «триадами» мышечного волокна

[Boncompagni, Protasi, 2007]. Это позволяет с большей долей уверенности говорить о функциональной взаимосвязи упомянутых структур, обеспечиваемой,

в первую очередь, колебанием концентрации кальция. Кроме того, известно, что кальциевые разряды в мышцах коррелируют с количеством и активностью митохондрий, которые способны подавлять высвобождение кальция [Isaeva, Shirokova, 2003, 2005].

Недавно было показано, что саркоплазматическая сеть также участвует и в делении митохондрий. Трубочки саркоплазматической сети опоясывают митохондрии и в некоторых местах существенно их пережимают. В местах такого контакта был обнаружен белок Drp1. Таким образом, саркоплазматическая сеть участвует в определении места перетяжки материнской митохондрии [Westermann, 2008].

Полученные нами результаты выявили существенные различия между корреляционными показателями, связывающими значение концентрации молочной кислоты в периферической крови до и после нагрузки глюкозой с относительным числом и удельным объемом митохондрий, расположенных в центре мышечного волокна и под сарколеммой. Межмиофибриллярные митохондрии при этом демонстрировали достоверную отрицательную корреляцию их числа и удельного объёма с показателями концентрации молочной кислоты до нагрузки и после нагрузки глюкозой, т.е. повышенное количество молочной кислоты в организме связано с меньшим количеством и удельным объёмом митохондрий в центре мышечного волокна. Это может объясняться относительной недостаточностью митохондриальной активности в условиях пониженного количества этих органелл, и соответствующим повышением концентрации молочной кислоты, как биохимическим проявлением этой недостаточности. В то же время, уровень концентрации молочной кислоты до нагрузки глюкозой связан выраженной положительной зависимостью с удельным объёмом субсарколеммальных митохондрий. Однако после часа нагрузки глюкозой выявляется отрицательная корреляция между этими переменными. Мы

111

объясняем это тем, что увеличение удельного объёма митохондрий,

располагающихся под сарколеммой мышечных волокон, имеет компенсаторное значение и носит вторичный по отношению к тканевому энергодефициту

(сопровождающийся повышением уровня молочной кислоты), характер.

Обнаруженная положительная корреляционная связь между числом митохондрий и уровнем пирувата в крови указывает на то, что увеличенное количество митохондрий успешно справляется с повышением концентрации пирувата спустя час после нагрузки глюкозой.

Большой интерес, по нашему мнению, представляют выявленные соотношения между формой митохондрий и концентрацией молочной кислоты в крови у больных врожденной миопатий центрального стержня. Обнаруженные в субсарколеммальной популяции митохондрий соотношения (положительная корреляция «эллипсоидности» с уровнем молочной кислоты до и через три часа после нагрузки) можно объяснить следующим образом: что более вытянутые митохондрии в большей степени, обеспечивают реакцию ткани в ответ на повышение уровня молочной кислоты. Показатель уровня молочной кислоты, как показывают выявленные нами другие корреляции, обратно пропорционален числу митохондрий. Таким образом, базовый уровень молочной кислоты в крови пациентов с миопатией центрального стержня в большей степени зависит от количества митохондрий (что подтверждается соответствующими коэффициентами корреляции), тогда как степень функциональной активности органелл в большей степени «отвечает» за реакцию ткани на повышение уровня глюкозы. Т.е. степень функциональной активности митохондрий, выражающаяся в их относительной «эллипсоидности», в большей степени связана с адаптационным потенциалом тканевых биоэнергетических реакций.

Субсарколеммальные митохондрии эллипсоидной формы, представляют собой более эффективный в функциональном отношении пул и их число связано положительной корреляцией с коэффициентом «лактат/пируват» после нагрузки глюкозой. В то же время, чем больше округлых митохондрий в субсарколеммальном участке, тем коэффициент «лактат/пируват» после нагрузки

112

меньше. Таким образом, наши данные подтверждают предположение о том, что округлые митохондрии являются менее функционально эффективными в отношении выполнения своих основных функций [Picard et.al., 2012, Cury et al, 2013]. Возможно, что округлые митохондрии являются относительно «молодыми органеллами», только что образовавшимися после почкования новых органелл.

Взаимоотношение показателя фактор «эллипс» субсарколеммальных митохондрий с другими биохимическими показателями, также подтверждает гипотезу о большой эффективности эллипсоидных органелл.

При этом данная форма «эллипс» митохондрий связана сильной отрицательной корреляцией со степенью тяжести заболевания. Выше сказанное свидетельствует о том, что увеличение количества эллипсоидных органелл под сарколеммой мышечных волокон является важным компенсаторным механизмом при заболеваниях мышц «немитохондриального» генеза. Интересным оказался тот факт, что в межмиофибриллярной популяции фактор «круг» митохондрий связан положительной корреляцией с концентрацией общего кальция в крови

(R=0,71, достоверность p<0,05), но в субсарколеммальной популяции корреляционной связи между этими переменными не выявлено. Все это может ещё раз указывать на то, что в разных участках мышечного волокна располагаются разные типы митохондрий, и они выполняют разные функции. В

разных работах, проведенных на кардиомиоцитах млекопитающих, было высказано предположение, что митохондрии в зависимости от их места расположения, обладают разной функциональной активностью [Твердохлеб, 1996].

Полученные данные показывают, что наиболее чёткие отличия в межмиофибриллярных и субсарколеммальных популяциях митохондрий выявлены между коэффициентом лактат/пируват и показателем «энергетического обеспечения мышечного волокна». В связи, с чем указанный показатель может эффективно использоваться для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в мышечной ткани. Этот же показатель отрицательно коррелирует со степенью тяжести заболевания и положительно коррелирует с биохимическими

113

параметрами (содержанием креатинина и общего кальция в крови).

Размеры митохондрий достоверно объединены корреляционными связями с показателями уровня пирувата, однако величина и направление этой связи различаются в субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондриях, что свидетельствует о принципиальных функциональных различиях митохондрий в двух рассматриваемых участках.

При миопатии центрального стержня выявлена отрицательная корреляция между удельным объёмом, размерными характеристиками межмиофибриллярных митохондрий и уровнем креатинина в крови, тогда как между этими же показателями в субсарколеммальной популяции была выявлена положительная корреляция. Эти данные также подтверждают предположения о функциональном различии межмиофибриллярных и субсарколеммальных митохондрий. Креатинин

- это продукт необратимого превращения креатина, являющегося продуктом распада фосфокреатина, отдающего свою фосфатную группу для восстановления концентрации АТФ в мышцах. Концентрация креатина определяется в организме в первую очередь его содержанием в мышечной ткани. Синтез фосфокреатина энергозависим и напрямую связан с активностью митохондрий. Таким образом,

уровень креатинина крови в определенной степени отражает интенсивность энергообмена и в частности митохондриальную активность в мышечной ткани.

Наши результаты показывают, что уровень креатинина напрямую связан с удельным объёмом субсарколеммальных митохондрий. Т. е. в соответствии с нашими предыдущими предположениями это отражает адаптационную способность субсарколеммальных митохондрий.

Обнаруженная положительная корреляционная связь, между удельным объёмом митохондрий их размерами, фактором «круг» в мышце с уровнем кальция в крови, может объясняться активностью митохондрий при стимуляции АТФ-зависимых кальциевых каналов сарколеммы, выводящих кальций во внеклеточную жидкость. Следовательно, чем больше объём митохондрий в мышцах, тем более активно выводится кальций из мышечных волокон.

Наиболее значимым представляется выявленные резко отрицательные

114

корреляции между количеством, удельным объёмом, эллипсоидностью, размерами субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания. Мы считаем,

что это свидетельствует, о том, что увеличение количества, размеров и удельного объёма митохондрий имеет очевидный компенсаторный эффект и напрямую связан с более легким течением заболевания. Следует особенно подчеркнуть, что выявленная корреляция имеет отношение в первую очередь к субсарколеммальным митохондриям. Этот факт, наряду свыше приведенными результатами, касающимися функциональных различий между межмиофибриллярными и субсарколеммальными популяциями митохондрий,

явно свидетельствует о том, что реабилитационный (адаптационный) потенциал системы энергообмена мышечной ткани напрямую связан именно с субсарколеммальной популяцией митохондрий. Очевидно, размеры митохондрий могут увеличиваться с достаточной компенсаторной эффективностью. Причем это компенсаторная активность их роста, строго специфична в отношении субсарколеммальных митохондрий.

4.2 Морфометрические характеристики митохондрий мышц при

митохондриальной миопатией

Обнаруженная достоверная положительная корреляция между показателем

«энергетической обеспеченности мышечного волокна» и удельным объёмом митохондрий, свидетельствует, о том, что при митохондриальной миопатии

увеличение энергетической мощности мышечного волокна сопровождается пропорциональным увеличением объёма митохондрий во всех участках мышечного волокна. Выявлена отрицательная корреляция между показателем

«энергетической обеспеченности мышечного волокна» и удельным объёмом миофибрилл.

В отличие от миопатии «центрального стержня», при митохондриальной миопатии увеличение объёма митохондрий в субсарколеммальной и межмиофибриллярном участке достигается только за счёт увеличения размеров

115

митохондрий (т.е. гипертрофии). Это подтверждает выявленная положительная корреляция между удельным объёмом митохондрий и их размерами в обеих популяциях.

В межмиофибриллярной популяции митохондрий обнаружена отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их электронно-

оптической плотностью. Это можно объяснить тем, что увеличение размеров митохондрий в большей степени связано с увеличением объёма матрикса, а не с разрастанием крист. Рост крист непосредственно связан с интенсивностью клеточного дыхания. Из литературы известно, что по скорости потребления кислорода по Чансу выделяют 5 метаболических (функциональных) состояний митохондрий. При этом митохондрии с темным плотным матриксом с более развитыми кристами являются наиболее активными, а со светлым матриксом и слабо развитыми кристами - менее активными. Набухание митохондрий,

сопровождаемое понижением оптической плотности, наступает и в отсутствие АДФ в состоянии покоя митохондрий. При добавлении АДФ стимулируется окислительное фосфорилирование. Цикл блокируется разобщителями окислительного фосфорилирования [Волькенштейн, 1978].

Кроме этого была выявлена положительная корреляция между размерами и формой фактор «эллипс» этих органелл. Таким образом, также как и при миопатии центрального стержня, чем больше удельный объём митохондрий, тем они становятся крупнее и принимают эллипсоидную форму.

Однако установленная отрицательная корреляция между относительным количеством межмиофибриллярных митохондрий и относительной электронной плотностью митохондрий указывает на то, что в межмиофибриллярных участках мышечных волокон мало функционально активных митохондрий.

Также в межмиофибриллярной популяции митохондрий обнаружена отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их электронно– оптической плотностью. Это, очевидно, позволяют сделать вывод о том, что эллипсоидность характерна для менее функционально активных органелл в этом участке. Таким образом, с увеличением размеров митохондрий форма этих

116

органелл меняется от округлой к эллипсоидной форме с более светлым матриксом и с менее развитыми кристами. Следовательно, можно предположить, что мышечное волокно может обслуживаться малым количеством мелких округлых митохондрий.

Выявленные нами соотношения между округлой формой митохондрий и степенью тяжести заболевания подкрепляет нашу гипотезу, основанную на предположении, что округлые митохондрии является более функционально активными и это объясняет выявленная отрицательная корреляция между этими переменными. Также это предположение подтверждается выраженной положительной корреляционной связью между эллипсовидной формой митохондрий их размерами и показателем «энергетической обеспеченности мышечного волокна» в межмиофибриллярном участке.

Положительная корреляция между удельным объёмом митохондрий и фактором «эллипс» в межмиофибриллярной популяции митохондрий указывает на то, что гипертрофия происходит также за счёт удлинения митохондрий, что говорит о возможном слиянии митохондрий. Мы предполагаем, что возможно в основе гипертрофии лежит слияние митохондрий, а не биогенез. Из литературы известно, что для митохондриальной миопатии характерна гетероплазмия – смесь нормальной и мутантной мтДНК в одной митохондрии, в клетке, в том или ином органе. При этом нормальная ДНК «дикого типа» может компенсировать патологический эффект мутации [Masucci et al.1995, Payne et.al. 2013]. Возможно,

что митохондрии с мутантными нуклеоидами сливаются, увеличиваются в размерах и становятся более удлиненными, эллипсоидной формы. В нашей работе было показано, что эллипсоидные митохондрии с более светлым матриксом,

являются менее функционально эффективными органеллами. Кроме того,

известно, что слияние митохондрий регулирует их количество и морфологию, а

также является механизмом контроля над обновлением и качеством митохондриальной популяции в течение интерфазы путём «перемешивания» мтДНК, белков и других молекул этих органелл [Ono et al., 2001; Sato et al., 2006 ].

Можно заключить, что возможно, происходит декомпенсация вследствие

117

того, что увеличение удельного объёма митохондрий происходит за счёт гипертрофии и слияния.

Выявленная отрицательная корреляция между числом субсарколеммальных

(но не межмиофибриллярных) митохондрий и концентрациями лактата в периферической крови больных митохондриальной миопатией, очевидно,

свидетельствуют о том, что число органелл именно в этом участке может варьировать и играть, таким образом, существенную роль в реализации обмена глюкозой. По всей видимости, большее количество субсарколеммальных митохондрий более эффективно осуществляет этот метаболизм и соответственно сопровождается меньшими концентрациями лактатка. Учитывая, что последний параметр в нашем исследовании оценивался в периферической крови, а также то,

что митохондриальная миопатия во всех исследованных случаях сопровождалась другими органными нарушениями (мозга, органов чувств и т.д.), можно предположить, что в численности митохондрий в субсарколеммальных участках мышц, может иметь адаптационное значение для всего организма при полисистемной митохондриальной недостаточности.

Отмеченное различие между субсарколеммальными и межмиофибрилляр-

ными митохондриями у больных митохондриальными миопатиями, выявляется в том, что только у первых из них отмечается выраженная взаимосвязь между числом, удельным объёмом митохондрий и уровнем креатинина в крови.

Следовательно, количество субсарколеммальных (но не межмиофибриллярных)

митохондрий влияет на интенсивность энергообмена в мышце.

Нами показано, что удельный объём субсарколеммальных митохондрий отрицательно коррелирует с активностью лактатдегидрогеназы в крови.

Очевидно, этот факт также следует объяснять с позиции вышеприведенной гипотезы об адаптационном значении увеличения объёма митохондрий в субсарколеммальных участках.

В контексте настоящего обсуждения, важно отметить, что количество митохондрий во всех участках мышечного волокна не было связано достоверным соотношением со степенью тяжести заболевания. Считаем, это принципиальной

118

особенностью митохондриальных миопатий, при которых число данных органелл

содной стороны не определяется жестко патологическим процессом,

составляющим основу большинства нозологических форм. С другой стороны,

адаптационная вариабельность этого показателя в отличие от

«немитохондриальных» заболеваний не является достаточно эффективной, чтобы воздействовать на тяжесть заболевания в целом.

Размеры митохондрий при митохондриальных миопатиях связаны корреляцией с содержанием пирувата и лактата в крови больных. Эта связь с коэффициентом «лактат/пируват» является положительной (т.е. прямо обратно пропорционально содержанию пировиноградной кислоты). Такие взаимоотношения прослеживаются в обеих популяциях митохондрий до нагрузки глюкозой. Обращает на себя особое внимание, что через три часа эта корреляция между субсарколеммальными митохондриями и коэффициентом «лактат/пируват» резко изменяется, приобретая отрицательное значение. Сопоставляя эти данные с приведенным выше обсуждением по поводу соотношения плотности функционального состояния митохондрий, можно предположить, что более крупные и светлые органеллы менее эффективно справляются с метаболизмом глюкозы. В то же время обнаруженная нами отрицательная корреляция между размерами митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» через три часа после нагрузкой глюкозой, объясняется резким появлением положительной корреляции размеров этих органелл с концентрацией пирувата. Вероятно, установленный факт является доказательством значительного истощения митохондрий через определенное время после нагрузки в условиях митохондриального заболевания.

Предположения о компенсаторной роли увеличения числа субсарколеммальных митохондрий в мышцах у больных митохондриальными миопатиями также находят свое подтверждение при анализе взаимоотношения введенными нами показателя» энергетического обеспечения мышечного волокна» с концентрациями креатинина.

119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы стремительно растет число больных наследственными нервно-мышечными заболеваниями (в частности митохондриальной миопатией).

В связи, с чем необходимы новые методы дифференциальной диагностики данных заболеваний. Морфологическим исследованиям при диагностике миопатий придают особое значение. Впервые был проведен полноценный морфо-

метрический анализ митохондрий в скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатии центрального стержня и митохондриальной миопатией. В

заключение можно сказать, что данные нашего исследования свидетельствуют о большой информативности морфометрического метода в оценке адаптационных изменений митохондрий при наследственно обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани. В проведенной работе доказана компенсаторная роль изменения числа и размеров митохондрий в скелетной мышечной ткани, которая напрямую связанна со снижением степени тяжести заболевания при наследственных нервно-

мышечных заболеваниях. Проведенный морфометрический анализ митохондрий важен как в теоретическом отношении (для гистологической характеристики адаптационных изменений митохондрий при функциональном напряжении клетки, так и для патологических изменений этих органелл при наследственных нарушениях энергообмена), а также и в практическом отношении – данные могут быть использованы в качестве дополнительных критериев дифференциальной диагностики врожденных нервно-мышечных заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. При врожденной миопатии центрального стержня количество и размеры митохондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках мышечных волокон существенно различаются между собой, в то время как форма и электронная плотность этих органелл в вышеуказанных участках одинаковы;

Выявлена достоверная отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их количеством, при этом удельный объём митохондриальной популяции в большей степени зависит от размеров отдельных органелл, а не от их количества.

120