протоколы всеее

Протокол № 13 Иммунодиагностика вирусного гепатита В (ВГВ)

В качестве исследуемого материала использовали образцы сыворотки пятиобследованных с подозрением на ВГВ. В сыворотке крови определяли маркеры ВГВ: НВs- и НВе-антигены, антитела к антигенам вируса гепатита В

(анти-HBs-антитела, анти-HBc-IgM, анти-HBc-IgG, анти-HBe-IgG), ДНК вируса гепатита В.

Определение маркеров ВГВ проводили путем постановки «сэндвич»- и непрямого методов ИФА (схема 1 и схема 2), а также ПЦР.

Схема 1. Схема постановки ИФА («сэндвич») для определения антигенов ВГВ

Схема 2.

Схема постановки ИФА (непрямого) для определения антител к ВГВ

Условные обозначения:

К+ - положительная контрольная сыворотка К- - отрицательная контрольная сыворотка КК – контроль конъюгата №1 – сыворотка №1 №2 - сыворотка №2 №3 - сыворотка №3 №4 - сыворотка №4 №5 - сыворотка №5

Учет ИФА производили с помощью мультискана (схема 3,4).

Схема 3.

Учет ИФА для определения антигенов ВГВ

Схема 4.

Учет ИФА для определения антител к ВГВ

Определение ДНК вируса гепатита В проводили методом ПЦР с набором специфических праймеров в режиме реального времени.

Результаты определения маркеров ВГВ

Заключение

На основании результатов определения маркеров ВГВ (ИФА и ПЦР) считаем, что у обследованного №1 подтвержден диагноз «острая форма гепатита В», у обследованного №2 - «хронический интегративный ВГВ (носитель вируса ВГВ)», у обследованного №3 - «хронический репликативный ВГВ», у обследованного №4 - иммунитет после вакцинации, у обследованного №5 - иммунитет после перенесенного ВГВ.

Протокол № 14 Бактериологическое исследование отделяемого носа обследованного на

стафилококковое бактерионосительство

1 этап исследования

У обследованного на стафилококковое бактерионосительство отобрали слизь из передних отделов носа одним стерильным зондом-тампоном, вмонтированным в стерильную пробирку или одноразовую пробирку (тубсер). Для этого тампон извлекли из пробирки, ввели сначала в одну ноздрю и вращательным движением собрали материал с крыльев носа и верхнего угла носового отверстия, затем повторили манипуляцию для другой ноздри. Тампон поместили в пробирку и доставили в лабораторию.

Посев материала произвели не позднее, чем через 2 часа после его забора на желточно-солевой агар (ЖСА) непосредственно тампоном, которым забирали материал (многократно поворачивая его, чтобы перенести на среду максимальное количество взятого материала).

Чашки поместили в термостат на 24 часа при +370С, затем оставили еще на одни сутки при комнатной температуре на свету для создания оптимальных условий для пигментообразования.

2 этап исследования

Учет роста. На ЖСА обнаружены круглые, блестящие, выпуклые, непрозрачные колонии среднего размера, с золотистым пигментом, окруженные зонами опалесценции, свидетельствующими о наличии фермента патогенности лецитиназы.

Подсчитали количество таких колоний – 110 шт.

Для накопления чистой культуры не менее двух колоний, подозрительных на золотистый стафилококк, отсеяли на скошенный МПА.

Посевы термостатировали сутки при +370С.

3 этап исследования

На скошенном МПА - рост в виде гомогенного непрозрачного золотистого налета.

Для изучения морфологических и тинкториальных свойств накопленной культуры сделали мазок и окрасили по Граму. В мазках - Грам+ кокки, расположенные в виде гроздьев винограда.

Для определения фермента патогенности плазмокоагулазы (основной дифференциальный тест) в стерильную пробирку с 0,5 мл цитратной кроличьей плазмы (ЦКП) внесли одну петлю культуры стафилококка и выдержали при +370С.

Через 2 часа плазма свернулась (образовался желеобразный сгусток). Произвели пересчет количества выделенных бактерий S.aureus на 1 мл

исследованного материала с помощью соответствующей таблицы и установили, что обсемененность (110 колоний) выше 103 КОЕ/мл.

Заключение:

На основании определения мофологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств считаем, что из носа обследованного выделена культура S.aureus в количестве выше 103 КОЕ/мл.

Протокол № 15 Бактериологическое исследование крови больного с подозрением на

сепсис (предположительно стрептококковой этиологии)

1 этап исследования

У больного с подозрением на сепсис через 2 часа после подъема температуры до начала антибиотикотерапии с соблюдением правил асептики отобрали исследуемый материал - две пробы крови из двух локтевых вен. Для этого участок кожи над пунктируемой веной обработали тампоном, смоченным в 70% спирте, затем другим тампоном, смоченным 2% раствором йода. Забор крови из вены производили в объеме 10 мл одноразовым шприцем над пламенем спиртовки с последующим посевом непосредственно у постели больного во флаконы со 100 мл питательных сред, приготовленных

влаборатории:

-сахарным бульоном (для выделения аэробов и факультативных анаэробов);

-тиогликолевой средой (для выделения анаэробов).

Дополнительно использовали среду Сабуро (для выделения грибов). Доставку материала в лабораторию осуществляли при комнатной температуре в течение 1-2 часов.

Емкости с засеянной кровью поместили в термостат при +370С и просматривали ежедневно до появления признаков роста (максимальный срок наблюдения — 9-10 дней).

Параллельно с посевом произвели микроскопическое исследование крови путем приготовления двух мазков по типу «толстой капли»: каплю крови растирали в центре предметного стекла по диаметру приблизительно 2 см, высушивали, один мазок фиксировали и окрашивали по Граму, другой не фиксировали и аккуратно окрашивали метиленовым синим 2-3 мин.

Микроскопировали под иммерсионным увеличением. Обнаружили небольшое количество грамположительных кокков, расположенных в виде цепочек.

2 этап исследования

На сахарном бульоне и тиогликолевой среде - рост в виде осадка. В мазках - Грам+ кокки, расположенные цепочками.

Из всех положительных проб сделали пересев на сектора кровяного агара (КА).

КА помещали в термостат при +370С на 1-2 суток.

3 этап исследования

На пластинке КА отмечали рост большого количества однотипных мелких нежных полупрозрачных колоний с ровными краями, сероватым оттенком, окруженных обширными зонами прозрачного β-гемолиза.

В мазках - Грам+ кокки, расположенные цепочками.

Произвели постановку тестов для родовой и видовой идентификации стрептококков:

1)тесты Шермена (на толерантность) - рост в сахарном бульоне при +100С и +450С, рост в солевом бульоне с 6,5% NaCl, в щелочном бульоне при рН 9,6, в 40%-м желчном бульоне, на молоке с метиленовой синью.

2)биохимические тесты (окисление маннита, реакция Фогеса-Проскауэра)

Для определения серологической группы по Ленсфильду произвели постановку реакции латекс-агглютинации. Выделенная культура относится к серогруппе В.

Определяли чувствительность выделенной культуры стрептококков к антибиотикам диско-диффузионным методом по стандартной методике.

4 этап исследования

Произвели учет дифференциальных тестов. В сахарном бульоне при +100С и +450С, в солевом бульоне с 6,5% NaCl, в щелочном бульоне при рН 9,6, в 40%-м желчном бульоне, на молоке с метиленовой синью рост отсутствует.

Реакция Фогеса-Проскауэра - положительная.

Заключение

На основании изучения морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных свойств считаем, что из крови больного выделена культура Streptococcus agalactiae.

Протокол № 16 Бактериологическое исследование носоглоточной слизи больного с

подозрением на назофарингит менингококковой этиологии

1 этап исследования

У больного с подозрением на назофарингит менингококковой этиологии взяли слизь с задней стенки глотки натощак стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон ввели концом кверху за мягкое небо в носоглотку, провели 2-3 раза по задней стенке и извлекли, не касаясь зубов, слизистой щек, языка.

Тампон опустили в пробирку с транспортной средой и доставили в лабораторию в специальных контейнерах (+37°С) в течение 2-4 часов.

Материал засеяли на 2 чашки: пластинку 20% сывороточного агара и 20% сывороточного агара с линкомицином (для подавления роста Грам+ кокков - нормальных обитателей ВДП). Пpи посеве материал втирали тампоном на поверхности 1х2 см, а затем этим же тампоном делали посев штрихами.

Чашку поместили в термостат при +37°С, повышенной влажности и 5-10% С02 на сутки.

2 этап

Учет роста. На 20% сывороточном агаре и 20% сывороточном агаре с линкомицином обнаружили рост характерных для менингококков колоний: бесцветных, нежных, полупрозрачных, средних размеров (2-3 мм) с ровными краями и гладкой поверхностью, вязкой консистенции.

Из колоний приготовили мазки и окрасили по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам -, ярко розовые диплококки бобовидной формы.

Для накопления выделенной чистой культуры колонии отсеяли на скошенный сывороточный агар.

Посевы термостатировали сутки при +37°С и повышенной влажности.

3 этап

Учет роста. На скошенном сывороточном агаре обнаружили рост в виде сплошного полупрозрачного налета.

Для проверки чистоты накопленной культуры сделали мазки по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам-, ярко розовые диплококки бобовидной формы.

Произвели идентификацию выделенной чистой культуры с использованием следующих тестов:

-оксидазный и каталазный – положительно,

-окисление сахаров путем посева на чашки с 20% сывороточным агаром, содержащие один из углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, фруктоза) и индикатор;

-посев на бессывороточный МПА;

- посев на 20% сывороточный агар с 0,2% желчи. Посевы поместили в термостат на сутки при +37°С.

4 этап

Учет дифференциальных тестов:

-окисление сахаров: глюкоза «+», мальтоза «+», сахароза «-», лактоза «-», фруктоза «-»;

-на бессывороточном МПА - рост отсутствует;

-на 20% сывороточномагаре с 0,2% желчи – рост отсутствует. Идентифицировали вид нейссерий с помощью таблицы.

Произвели определение серогруппы, выделенной культуры Neisseria meningitidis в реакции агглютинации на стекле с помощью агглютинирующих сывороток против менингококков серогрупп А, В, С. Для этого на предметное стекло, разделенное маркером на три части, нанесли физ. раствор (по капле на каждую часть). Далее стерильной петлей с поверхности агаровой среды отобрали культуру менингококков и тщательно суспендировали в каплях физиологического раствора на стекле. После этого, если не выявлено спонтанной агглютинации с физ. раствором, в три подготовленные части добавили антисыворотки А, В и С (по капле) и перемешали.

Учет реакции произвели через 1 - 2 мин. Наблюдали образование крупных хлопьев на фоне полного просветления агглютинационного поля в капле с антисывороткой А и гомогенное помутнение в каплях с антисыворотками В и С.

Заключение

На основании изученных морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных свойств считаем, что из носоглотки больного с подозрением на назофарингит менингококковой этиологии выделена культура Neisseria meningitidis серогруппы А.

Протокол № 17 Бактериологическое исследование ликвора больного

сподозрением на гнойный менингит (менингококковой этиологии)

1этап исследования

1.Ликвор взяли при пункции в объеме 2,0-5,0 мл. Первую порцию направили в клинико-диагностическую лабораторию для проведения ликворологического и цитологического исследований (1,0 мл) и постановки ПЦР (0,2 мл). Вторую порцию засеяли в чашку с «шоколадным агаром» и пробирку с 20% сывороточным полужидким агаром путем накапывания непосредственно из пункционной иглы (по 0,5 мл). Еще 1 мл отобрали в пробирку для бактериоскопии и серологических исследований. Материал доставили в бактериологическую лабораторию в течение 1-2 ч. в сумках-термостатах.

2.В лаборатории посевы поместили в термостат при 370С, повышенной влажности и 5-10% СО2.

3.Приготовили 2 мазка: один окрасили метиленовым синим без фиксации; второй – по Граму. В мазке увидели соответственно диплококки бобовидной формы, часть которых располагалась внутри нейтрофилов и Гр- диплококки аналогичной формы.

4.Для экспресс-индикации ликвор исследовали в реакции латексагглютинации с соответствующим диагностикумом: наблюдали «+» результат в виде хлопьевидного осадка.

2этап

Учет роста. На «шоколадном агаре» обнаружили рост характерных для менингококков колоний: бесцветных, нежных, полупрозрачных, средних размеров (2-3 мм) с ровными краями и гладкой поверхностью, вязкой консистенции.

Из колоний приготовили мазки и окрасили по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам -, ярко розовые диплококки бобовидной формы.

Для накопления выделенной чистой культуры колонии отсеяли на скошенный сывороточный агар.

Посевы термостатировали сутки при +37°С и повышенной влажности.

3 этап

Учет роста. На скошенном сывороточном агаре обнаружили рост в виде сплошного полупрозрачного налета.

Для проверки чистоты накопленной культуры сделали мазки по Граму в модификации Калины. В мазках - Грам-, ярко розовые диплококки бобовидной формы.