Molekuljarnaja Biologija Kletki v3
.pdf
111
Рис. 16-55. Возникновение сегментов тела дрозофилы в процессе эмбрионального развития. Представлено на рисунках (вид сбоку) (А-В) и на соответствующих микрофотографиях, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа (Г-Е). А, Г - после двухчасового развития эмбрион находится на стадии синцитиальной бластодермы (см. рис. 16-57). Сегментации не наблюдается, хотя уже можно нарисовать (окрашенные участки) карту презумптивных зачатков с расположением будущих сегментов. Б, Д - после 5-8 ч развития эмбрион находится на стадии удлинения зародышевой полоски: произошла гаструляция, начинают появляться сегменты и сегментированная ось тела удлиняется, изгибаясь на хвостовом конце и как-будто принимая форму яйцевой оболочки. В, Е - после 10 ч развития зародыша ось тела сокращается и вновь выпрямляется, все сегменты четко определены; структуры головы, видимые на этой стадии на поверхности личинки, начинают погружаться вглубь последней с тем, чтобы появиться вновь только после окукливания. (Г, Д - с любезного разрешения
Rudi Turner, Anthony Mahowald; E - c любезного разрешения Jane Petschek.)
булавовидных балансёров, необходимых для обеспечения полета (они образовались в результате эволюции второй пары крыльев, существовавших у более примитивных насекомых). Такая квазиповторяющаяся сегментация более выражена у личинки, у которой сегменты выглядят более унифицированными; на более ранних стадиях (у зародышей) можно видеть, что зачатки головы и участки, формирующие рост взрослого насекомого, также выглядят сегментированными (рис. 16-55). Границы сегментов в данном случае носят несколько условный характер,
Рис. 16-56. Сегменты личинки дрозофилы и их соответствие участкам бластодермы. Обратите внимание, что концевые области бластодермы соответствуют несегментированным структурам, которые формируют в основном внутренние части личинки, а также сегментированные зачатки ротового аппарата взрослой мухи. Сегментацию у дрозофилы можно описать, используя термины «сегменты» или «парасегменты»; их взаимосвязь указана в нижней части рисунка. До сих пор не установлено точное число сегментов брюшка: наличие восьми доказано, однако, вероятно, имеется и девятый. Мn-мандибула; Мх-максилла; La-губа
112
и на этот счет имеются особые соглашения. При обсуждении характера экспрессии генов мы увидим, что в целом принято говорить о существовании 14 парасегментов (обозначаемых Р1-Р14); это составляет половину числа традиционно определяемых сегментов (рис. 16-56). И, наконец, на обоих концах тела животного расположены высокоспециализированные структуры, не имеющие сегментарного происхождения.
Общий план строения всего тела, где представлены два специализированных конца и набор модулируемых повторений основной единицы, возникает в результате процессов, которые происходят в яйце и раннем эмбрионе в первые часы после оплодотворения.
16.5.2. Развитие дрозофилы начинается с образования синцития [46]
Длина яйца дрозофилы составляет около 400 мкм, а диаметр около 160 мкм; яйцо обладает ярко выраженной полярностью. Как и у других насекомых, развитие яйца в данном случае происходит достаточно необычно: в результате последовательных делений ядра, не сопровождающихся делением цитоплазмы, возникает синцитий. Ранние деления ядер синхронны и происходят в быстром темпе - через каждые 8 мин. В результате первых 9 делений возникает группа ядер, большая часть которых мигрирует из центра яйца к поверхности, где и формируется монослой, именуемый синцитиальной бластодермой. После следующих 4 делений ядер плазматические мембраны прорастают внутрь от поверхности яйцеклетки и окружают каждое из ядер. Так синцитиальная бластодерма превращается в клеточную бластодерму, которая содержит около 5000 отдельных клеток (рис. 16-57). Небольшая группа ядер, расположенных на самом заднем конце яйца, образует клетки на несколько циклов деления раньше. Эти полярные клетки представляют собой первичные половые клетки, которые положат начало поколениям яйцеклеток или спермиев. Как и в процессе деления у амфибий, высокая скорость репликации ДНК тормозит транскрипцию, так что до стадии клеточной бластодермы развитие в основном (хотя и не полностью) зависит от запасов материнской мРНК и белка, накапливающихся в яйцеклетке до оплодотворения. После образования клеток их деления приобретают более привычный характер, становятся асинхронными, скорость деления замедляется и резко повышается скорость транскрипции.
Зародыш дрозофилы на стадии клеточной бластодермы соответствует полой бластуле амфибий или морских ежей; отличие же состоит в том, что бластула амфибий и морских ежей заполнена жидкостью, а в центре зародыша на этой стадии у насекомых располагается желток. Гаструляция начинается после образования клеток. Хотя у насекомых геометрия этого процесса носит крайне специфические черты, общий результат сходен: благодаря координированным движениям клеток вдоль оси эмбриона возникает кишечная трубка из энтодермальных клеток; трубка окружена мезодермой, которая занимает пространство между этой трубкой и наружным листком эктодермы. В ходе гаструляции длинная ось эмбриона сначала вытягивается («удлинение
Рис. 16-57. Развитие яйца дрозофилы от момента оплодотворения до стадии клеточной бластодермы. [Н.А. Schneiderman, in Insect Development (P. A. Lawrence, ed.), pp. 3-34, Oxford, U.K., Blackwell, 1976.]
113
Рис. 16-58. Карта презумптивных зачатков эмбриона дрозофилы на стадии клеточной бластодермы (вид сбоку и поперечный разрез), раскрывающая связь между дифференцировкой важнейших типов тканей в дорсовентральном направлении и расположением сегментов вдоль переднезадней оси.
Утолщенная линия окружает участок, где формируются сегментированные структуры. В процессе гаструляции клетки, расположенные вдоль вентральной срединной линии, инвагинируют, образуя мезодерму, а клетки, которые позже сформируют пищеварительный тракт, инвагинируют вблизи обоих концов эмбриона. (V. Hartestein, G. M. Technau, J. A. Campos-Ortega, Wilhelm Roux Archiv Dev. Biol., 194, 213-216, 1985.)
зародышевой полоски») и затем вновь укорачивается («сокращение зародышевой полоски»); в результате удлинения ось тела изгибается в соответствии с упаковкой эмбриона под яйцевой оболочкой (рис. 16-55).
Наблюдая за поведением клеток в ходе сложных гаструляционных движений, можно нарисовать карту презумптивных зачатков для монослоя клеток, расположенных на поверхности бластодермы (рис. 16-58). Карта презумптивных зачатков выглядит наиболее просто на поперечных срезах через среднюю часть эмбриона; здесь будущая мезодерма расположена вентрально, а будущая эктодерма находится по обе стороны от нее. В данном случае как и у позвоночных вдоль всего тела проходит вытянутое скопление нервных клеток, возникающих из части эктодермы. В развитии насекомых мы находим этапы, соответствующие не только гаструляции и нейруляции, но и образованию сомитов: по завершении гаструляции на поверхности эмбриона наблюдаются бороздки и выступы, отмечающие подразделение тела на парасегменты вдоль переднезадней оси (рис. 16-55). Более точные тесты показывают, что основные черты такой сегментарной структуры определяются уже на стадии клеточной бластодермы до начала гаструляции.
16.5.3. План строения эмбриона контролируется в двух прямоугольных системах координат [47]
Для упрощения ориентации на бластодерме принято пользоваться двумя координатами - условными широтой и долготой. Было также показано, что, согласно генетическим тестам, формирование пространственной организации происходит за счет двух механизмов, один из которых определяет организацию по дорсовентральной оси, а другой - по переднезадней. Дорсовентральная ось контролируется группой, состоящей примерно из 20 генов: мутации любого из них приводят к развитию эмбрионов, которые как бы «дорсализованы», т. е. лишены вентральных структур, или «вентрализованы», т. е. лишены дорсальных структур. Другая группа, состоящая примерно из 50 генов, куда входят гены сегментации и гомеозисные селекторные гены, уже упоминавшиеся ранее, контролирует пространственную организацию вдоль переднезадней оси. Мутации этих генов приводят к развитию эмбрионов, у которых либо отсутствуют какие-либо элементы вдоль переднезадней оси, либо эти элементы дуплицированы. Хотя к настоящему времени многие гены из обеих групп клонированы и даже определены их белковые продукты,
114
тем не менее мы ограничимся рассмотрением пространственной организации зародыша только вдоль переднезадней оси.
16.5.4. Переднезадняя полярность эмбриона контролируется сигналами с обоих концов яйца дрозофилы [48]
Исходная полярность яйцеклетки контролируется распределением веществ, запасенных до оплодотворения в период нахождения ооцитов в яичнике (рис. 16-39). Если на переднем конце яйцеклетки дрозофилы проделать маленькое отверстие с тем, чтобы вытекло небольшое количество цитоплазмы, расположенной в самой передней части клетки, то эмбрионы теряют способность формировать структуры головы. Более того, если вместо утраченной цитоплазмы переднего конца инъецировать цитоплазму заднего конца из другой яйцеклетки, то в передней половине яйцеклетки-реципиента возникнет второй набор брюшных сегментов с обратной полярностью (рис. 16-59).
Были идентифицированы мутации, приводящие к подобным нарушениям структуры передней или задней частей эмбриона. Гены полярности яйца, которые были обнаружены с помощью таких мутантов, являются первыми элементами иерархической генетической системы, участвующей в формировании пространственной организации вдоль переднезадней оси. Гены полярности яйца относятся к числу генов, транскрибируемых в материнском геноме в ходе оогенеза; их запасенные продукты начинают действовать вскоре после оплодотворения. По этой причине фенотип эмбриона определяется аллелями матери, а не сочетанием отцовских и материнских аллелей, представленных в самом эмбрионе. Гены, экспрессируемые таким образом, называют генами материнского эффекта.
У матерей-гомозигот по мутации полярности яйца bicoid образуются эмбрионы без головы и торакальных (грудных) структур и за счет этого абдоминальные (брюшные) структуры занимают необычно большую часть всего тела; в свою очередь мутация полярности яйца oskar приводит к образованию зародышей, полностью лишенных абдоминальных сегментов. (Несегментированные структуры обоих концов тела находятся на особом положении: они не затрагиваются этими мутациями, но могут исчезнуть вследствие мутаций torso и некоторых других.)
Рис. 16-59. Локализованные детерминанты на концах яйца дрозофилы определяют его переднезаднюю полярность. Если на переднем конце яйца удалить небольшой участок цитоплазмы и заменить его цитоплазмой с заднего конца, то возникает аномальная личинка, имеющая два задних конца (фото справа); на фото слева представлена нормальная личинка. Личинки сфотографированы в темном поле. [H.J. Frohnhofer, R. Lehmann, С. Nusslein-Volhard, J. Embryol. Exp. Morphol, 97 (suppl.): 169-179, 1986.]
115
Мутации bicoid и oskar приводят к отсутствию соответствующих генных продуктов. Эти мутации можно устранить посредством инъекции мутантным эмбрионам нормальной цитоплазмы. Мутанты bicoid развиваются сравнительно нормально после инъекции цитоплазмы переднего конца нормальных эмбрионов в передний конец мутантного яйца, а мутант oskar нормализуется вследствие инъекции цитоплазмы заднего конца нормального эмбриона в будущий брюшной отдел мутанта. В обоих случаях нормальный генный продукт локализован на одном из концов яйца и действует как источник определенного сигнала, контролируя возникновение позиционных значений вдоль переднезадней оси.
Молекулярно-генетические эксперименты позволили прояснить ситуацию. С помощью гибридизации in situ клонированных кДНКзондов bicoid было показано, что мРНК, соответствующая гену bicoid, концентрируется на переднем конце яйца. Исходно эта мРНК синтезируется в яичнике питающими клетками, связанными с ооцитами (см. разд. 16.4.1, рис. 16-39). По мере перемещения bicoid-мРНК по цитоплазматическим мостикам в ооцит она прикрепляется к некоторым компонентам цитоплазмы (вероятно, к элементам цитоскелета) на переднем конце ооцита. Трансляция начинается только после откладки яйца. В результате возникает градиент концентрации белка bicoid с максимумом на переднем конце эмбриона. Градиент концентрации можно изменить генетически, создав мутанты, несущие множественные копии нормального гена bicoid: с увеличением дозы гена у матери увеличивается концентрация белка в яйце. Соответственно происходит смешение сегментов эмбриона по направлению к заднему концу, даже несмотря на то, что их расположение определяется позиционной информацией, возни-
Рис. 16-60. Градиент белка bicoid в яйцеклетке дрозофилы и его влияние на структуру сегментов. Градиент обнаруживается при обработке антителами против белка bicoid; характер сегментации выявляется при окрашивании антителами к продукту гена группы pair-rule, именуемого evenskipped (см. разд. 16.5.5). Сравниваются три эмбриона: не имеющий гена bicoid, имеющий одну копию этого гена и имеющий 4 копии. В отсутствие гена bicoid сегменты на переднем конце не формируются; с увеличением дозы гена они формируются все дальше от переднего конца зародыша, как если бы их расположение определялось концентрацией белка bicoid в данном участке. Изменение этой концентрации, как следует из интенсивности окраски, может быть представлено в виде графика. Несмотря на значительные различия в расположении зачатков сегментов, которые обнаруживаются между эмбрионами с одной и с четырьмя копиями гена, и те, и другие образуют вполне нормальные личинки и взрослых особей. Механизмы такой регуляции обсуждаются в разд. 16.4.9.
116
кающей под действием концентрации белка bicoid в данном участке (рис. 16-60). Эти соображения позволяют отнести данный белок к морфогенам
(см. разд. 16.4.2).
16.5.5. Действие трех классов генов сегментации приводит к подразделению эмбриона на сегменты [49]
Продукты генов полярности яйца обеспечивают появление универсальных градуальных сигналов, определяющих возникновение системы отдельных сегментов. Этот процесс зависит от действия генов сегментации, образующих группу примерно из 20 генов. Мутации этих генов способны изменять число сегментов или их основные внутренние свойства, не затрагивая общую полярность яйца. Гены сегментации по сравнению с генами полярности яйца действуют на более поздних стадиях. С учетом действия этих генов фенотип эмбриона будет полностью или частично определяться генотипом эмбриона, а не только матери. Таким образом, эти гены следует отнести к группе генов эффекта зиготы.
Большинство мутаций генов сегментации летальны; их эффект не проявляется у взрослых мух, поскольку мутанты погибают, не достигнув продвинутых стадий развития. Однако такие летальные мутации могут распространяться в рецессивном состоянии (как это обычно и бывает). Следовательно, жизнеспособными оказываются гетерозиготы, обладающие двумя копиями гена: одной нормальной и другой мутантной. При скрещивании гетерозиготных родителей четвертую часть потомства составляют гомозиготы, несущие две копии мутантного гена. Такие потомки погибают преждевременно на поздних эмбриональных или ранних личиночных стадиях, но они живут достаточно долго, чтобы мог проявиться измененный фенотип. Почти все гены сегментации были обнаружены в результате воздействия на мух мутагенами и последующего изучения десятков тысяч погибающих личинок, которые были получены в результате скрещивания мутантных форм.
Гены сегментации подразделяют на три класса (рис. 16-61). Первыми в действие вступают по меньшей мере три gap-гена, действие продуктов которых приводит к появлению наиболее грубого подразделения эмбриона. Мутации любого gap-гена сопровождаются исчезновением обширных участков последовательных сегментов, а мутации различных gap-генов приводят к появлению различных, но частично перекрывающихся дефектов. Например, личинка мутантная по гену Krűppel лишена 8 сегментов от Т1 до А5 включительно (соответственно парасегменты РЗ-Р10).
Рис. 16-61. Фенотипическое проявление мутаций, затрагивающих три типа генов сегментации. В каждом случае участки, выделенные цветом у нормальных личинок (слева), у мутанта делетированы или заменены зеркальными повторами не затронутых участков. Доминантные мутации принято обозначать прописными буквами, а рецессивные - строчными. Несколько мутаций, затрагивающих строение тела дрозофилы, относят к доминантным вследствие их выраженного влияния на фенотип гетерозигот, хотя по основной характеристике (летальному эффекту) они рецессивны, т.е. проявляются только у гомозигот. (С. Nűsslein-Volhard, Е. Wieschaus, Nature, 287, 795-801, 1980; с небольшими изменениями.)
117
Следующими генами сегментации, вступающими в действие, являются 8 генов pair-rule. Мутации этих генов вызывают серию делеций, повреждающих чередующиеся сегменты, что приводит к сохранению только половины сегментов. Такая парно-сегментарная периодичность характерна для всех мутантов по генам pair-rule, но они отличаются по локализации мутаций в границах сегментов или парасегментов. Например, один из мутантов pair-rule, именуемый even-skipped, теряет все четные парасегменты, а другой -fushi tarazu (ftz) - теряет все нечетные парасегменты. Мутация этого же класса, названная hairy, приводит к исчезновению серии участков одинаковой ширины, которые не совпадают с парасегментами. Наконец, существует около 10 генов полярности сегментов. Мутации этих генов приводят к утрате части сегмента и ее замещению зеркальной копией всего сегмента либо его части. Например, у мутантов gooseberry задняя половина каждого сегмента, т. е. передняя половина каждого парасегмента, заменяется почти зеркально перевернутой передней половиной соответствующего сегмента (см. рис. 16-61).
Анализ фенотипа различных мутантов по генам сегментации приводит к предположению, что гены сегментации формируют координированную систему, которая делит развивающийся эмбрион на все более мелкие домены, различающиеся по характеру генной экспрессии.
Издесь молекулярная генетика также позволяет изучать механизмы, лежащие в основе действия этой системы.
16.5.6.Локализованная экспрессия генов сегментации регулируется иерархической системой позиционных сигналов [44, 50]
Несколько генов из каждой группы генов сегментации было клонировано и соответствующие зонды использованы для локализации транскриптов в нормальных эмбрионах по методу гибридизации in situ (см. разд. 4.6.11). Мы уже обсуждали ранее, как этот метод был использован для демонстрации того, что транскрипты гена bicoid являются источником позиционного сигнала: транскрипты локализуются на одном из концов яйца, хотя эффекты мутации гена распространяются на большую часть эмбриона. Подобным образом было показано, что некоторые гены сегментации (а именно gap-гены) в свою очередь прямо или косвенно участвуют в формировании позиционных сигналов, которые позволяют контролировать характер развития в ближайшем окружении. Например, мутанты, дефектные по gap-гену Krűppel, обладают выраженной аномалией, распространяющейся через участок, где были выявлены транскрипты данного гена в нормальном эмбрионе, а также на несколько сегментов за его пределами (рис. 16-62). Ген Krűppel был секвенирован и оказался гомологичен (равно, как и другой gap-ген-hunchback) семейству генов, о которых известно, что у позвоночных они кодируют
Рис. 16-62. Пространственные домены, в которых действует дар-ген Krűppel, картированный на бластодерме дрозофилы. А. На рисунке показано, как дефект, вызванный отсутствием функционального продукта Krűppel, простирается за пределы участка, в котором в норме локализованы транскрипты Krűppel. Б. Нормальное распределение транскриптов Krűppel согласно результатам гибридизации in situ на стадии бластодермы. В. Нормальное распределение белка Krűppel, выявляемое с помощью окрашивания антителами на этой же стадии. На других стадиях белок может быть распространен более широко. Фенотип мутанта, у которого отсутствует функциональный продукт Krűppel, указан на рис. 16-61, А. (Б - из Н. Jackele, D. Tautz, R. Schuh, E. Seifert, E. Lehmann, Nature, 324, 668-670, 1986; В - из U. Gaul, E. Seifert, R. Shuh, H. Jackle, Cell, 50, 639-647, 1987, copyright Cell Press.)
118
Рис. 16-63. При гибридизации in situ радиоактивного ДНК-зонда для гена ftz с бластодермой дрозофилы среди продуктов транскрипции данного гена обнаруживается семь полос, что соответствует проявлению дефектов у мутантов по ftz. На радиоавтографе полосы экспрессии ftz выявляются на продольном срезе в виде черных точек, образованных зернами серебра. (С любезного разрешения Philip Ingham.)
ДНК-связывающие регуляторные белки, включая фактор транскрипции TFIIIA у Xenopus (см. разд. 9.1.9). Возникает соблазн предположить по аналогии с bicoid, что белок Krűppel в роли диффундирующего морфогена распространяется из участка транскрипции Krűppel, хотя наблюдаемое распространение белка не столь обширно, как требуется в соответствии с этой гипотезой.
Некоторые гены группы pair-rule участвуют в передаче сигналов на более короткие расстояния, оказывая воздействие на клетки, соседствующие с участками транскрипции этих генов; другие гены, напротив, оказывают воздействие на развитие только в тех участках, где они транскрибируются. Например, транскрипты нормального гена ftz на стадии бластодермы проявляются в виде семи кольцевых полосок, наподобие полос у зебры (рис. 16-63), отмечающих ширину и расположение зачатков четных парасегментов, которые утрачиваются у мутантов ftz.
Подводя итоги этих наблюдений, можно предположить, что продукты генов полярности яйца обеспечивают эмбрионы универсальными позиционными сигналами, вынуждающими экспрессироваться определенные gар-гены в определенных местах. В свою очередь продукты gap-генов представляют как бы второй ярус позиционных сигналов, действующих более локализованно и используемых для регуляции более тонких деталей пространственной организации эмбриона, и оказывающих в свою очередь влияние на экспрессию еще одной группы генов, куда входят и гены группы pair-rule. Таким образом, универсальные градиенты, создаваемые генами полярности яйца, принимают участие в формировании более мелких деталей пространственной организации путем постепенного подразделения по принципу иерархии последовательных позиционных контролей. Это весьма надежная стратегия: поскольку позиционные сигналы не определяют подробных деталей, отдельные ядра, отвечающие на них, не должны реагировать с высокой точностью на минимальное изменение величины таких сигналов.
16.5.7. Продукты одного гена сегментации контролируют экспрессию другого [44, 50, 51]
Согласно представленной выше схеме, иерархия позиционных сигналов должна соответствовать иерархии регулярных взаимодействий между генами, управляющими формированием пространственной организации. Это положение можно проверить при изучении влияния мутации одного гена на экспрессию другого. Оказалось, что гены, участвующие в процессе формирования пространственной организации вдоль переднезадней оси, формируют иерархическую пирамиду в пяти основных ярусах, причем продукты генов каждого яруса регулируют экспрессию генов
119
нижележащих ярусов. На вершине этой пирамиды находятся гены полярности яйца, за ними gap-гены, затем гены pair-rule, затем гены полярности сегментов и, наконец, гомеозисные селекторные гены.
Можно получить мутантные эмбрионы, лишенные нормальных продуктов гена Krűppel, и определить методом гибридизации in situ экспрессию нормального гена ftz, используя клонированный зонд комплементарный последнему. Характерные полоски ftz не образуются именно в тех участках бластодермы, которые затронуты мутацией Krűppel. Следовательно, продукт гена Krűppel прямо или косвенно регулирует экспрессию гена ftz. Вместе с тем, у мутантов ftz распределение нормального продукта Krűppel не нарушено: подукт ftz не регулирует экспрессию гена Krűppel.
Иногда наблюдается взаимодействие между генами одного яруса иерархической пирамиды; в отличие от взаимодействия генов Krűppel и ftz некоторые из этих взаимодействий могут иметь реципрокный (т. е. перекрестный) характер. Например, gap-гены Krűppel и hunchback взаимно ингибируют друг друга, что не позволяет экспрессироваться их продуктам в ядрах эмбриона одновременно. Поэтому в норме они экспрессируются в соседних участках бластодермы с четкой границей между областью экспрессии гена hunchback, расположенной спереди, и областью экспрессии гена Krűppel, расположенной сзади. Но в отсутствие одного из продуктов этой пары генов область другого продукта расширяется за пределы обычной демаркационной линии. Явление взаимного ингибирования, проявляемое этими двумя генами, которое вынуждает ядро каждой из клеток совершать выбор между тем или иным направлением специализации, может быть использовано для объяснения того, каким образом в ответ на непрерывный градиент морфогена возникает набор строго определенных неперекрывающихся областей экспрессии.
Рис. 16-64. А. Характер транскрипции четырех из восьми известных генов группы pair-rule и одного гена полярности сегмента engrailed в бластодерме дрозофилы. Хотя каждый из генов группы pair-rule сам по себе определяет только простое чередование с шагом в два сегмента, деятельность всего набора генов pair-rule в сочетании приводит к определению соседствующих и перекрывающихся структур и может вызывать значительно более тонкое и сложное разбиение всей бластодермы на полосы шириной всего в одну клетку, в которых и экспрессируется ген engrailed. Б. Проявление экспрессии гена engrailed у пятичасового эмбриона (стадия удлинения зародышевой полоски), десятичасового эмбриона и у взрослой мухи, крылья которой на этом препарате были удалены. Данная картина экспрессии выявляется с помощью антител против белка engrailed (для пятичасового) или (для двух других образцов) путем создания линии мух, несущих регуляторные последовательности гена engrailed, связанные с кодирующей последовательностью гена ферментарепортера, чье присутствие легко выявляется гистохимически по образованию окрашенного продукта в процессе реакции, катализируемой этим ферментом. Обратите внимание, что распределение белка engrailed после его появления сохраняется в течение всей жизни животного.
(А -по М. Akam, Development, 101, 1-22, 1987; Б - с любезного разрешения Тот Kornberg.)
120
Вероятно, регулярная периодическая картина экспрессии генов pair-rule устанавливается сходным образом. Здесь градуальные позиционные сигналы, определяемые экспрессией генов дар, задают примерное направление развития, а взаимодействие генов pair-rule (например, генов hairy и runt) приводит к более строгой и точной детализации. Таким образом, области экспрессии различных генов группы pair-rule формируют точно воспроизводимое распределение взаимных исключений и перекрываний в каждом из двусегментных модулей бластодермы нормального эмбриона (рис. 16-64). Различные полоски клеток бластодермы, опоясывающих зародыш, характеризуются различной комбинацией экспрессии генов pair-rule, которая, будучи организована по принципу иерархии, спускается до минимально возможного уровня детализации-до ширины одиночной клетки, что соответствует примерно 1/4 ширины будущего сегмента или парасегмента.
16.5.8. Гены полярности яйца, gap-гены и раir-rule-гены создают временную пространственную организацию; гены полярности сегментов и гомеозисные селекторные гены обеспечивают постоянную запись [44, 52]
События, описанные в предыдущем разделе, происходят в течение первых нескольких часов после оплодотворения. Gap-гены и гены pair-rule активируются один за другим и кодируемые ими мРНК (наблюдаемые с помощью гибридизации in situ) создают усредненную и сильно огрубленную (по сравнению с конечным результатом) картину. Вновь синтезируемые продукты сами регулируют экспрессию генов до тех пор, пока вследствие реализации серии взаимных приспособлений, исходное распределение генных продуктов не выявляется в виде четко определенной системы повторяющихся полос. Но и эта система нестабильна и носит временный характер. По мере развития эмбриона от стадии гаструлы и далее регулярное посегментное расположение продуктов генов групп дар и pair-rule исчезает. Но их действие привело к возникновению временного набора позиционных значений, т. е. молекулярных адресов клеток бластодермы, которые будут поддерживать сегментарную организацию личинки и взрослого животного. Эти позиционные значения записаны с помощью сохраняющейся активации генов полярности сегментов и гомеозисных селекторных генов.
16.5.9. Гены полярности сегментов контролируют основные подразделения каждого из парасегментов [44, 53]
В отдельных участках всех парасегментов наблюдается сходная картина экспрессии генов полярности сегментов. Хорошим примером тому является ген engrailed. Присутствие его мРНК можно продемонстрировать с помощью гибридизации in situ на стадии клеточной бластодермы, где эта мРНК формирует серию из 14 полос шириной в одну клетку, расположенных в самых передних частях будущих парасегментов. Появление этих полос тесно связано с экспрессией полос, соответствующих генам pair-rule (см. рис. 16-64); наблюдая за нарушениями распределения полос engrailed у мутантов pair-rule, можно сформулировать правила включения генов engrailed. По всей вероятности, ключевую роль здесь выполняет одно из двух специфических сочетаний продуктов генов pair-rule: в четных парасегментах ген engrailed проявляется только после экспрессии генов ftz и odd-paired, а в нечетных - после экспрессии сочетания even-skipped и paired. Иные сочетания продуктов генов pair-rule