СРАВНИТЕЛЬНАЯ БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ (экспериментальное исследование)тема диссертации и автореферата по ВАК 03.01.04, кандидат медицинских наук Бачко, Сергей Сергеевич

Share on vkShare on facebookShare on twitterShare on mymailruShare on odnoklassniki_ruShare on livejournalShare on surfingbirdMore Sharing Services

СРАВНИТЕЛЬНАЯ БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ (экспериментальное исследование)тема диссертации и автореферата по ВАК 03.01.04, кандидат медицинских наук Бачко, Сергей Сергеевич

Share on vkShare on facebookShare on twitterShare on mymailruShare on odnoklassniki_ruShare on livejournalShare on surfingbirdMore Sharing Services

Автореферат

Начало формы

Конец формы

Диссертация

Начало формы

Конец формы

Артикул: 447876

Год: 

2011

Автор научной работы: 

Бачко, Сергей Сергеевич

Ученая cтепень: 

кандидат медицинских наук

Место защиты диссертации: 

Краснодар

Код cпециальности ВАК: 

03.01.04

Специальность: 

Биохимия

Количество cтраниц: 

155

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Бачко, Сергей Сергеевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ И МЕТОДЫ ЕГО МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ КОРРЕКЦИИ.

1.1. Общие представления о механизмах гепатотоксического действия химических веществ.

1.2. Характеристика физико-химических свойств четыреххлористого углерода. Механизм его гепатотоксичности. Влияние CCU на протекание обменных процессов в организме.

1.3. Фармакотерапия заболеваний гепатобилиарной системы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В

СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ.

2.1. Характеристика экспериментальных животных.

2.2. Методика создания модели токсического поражения печени.

2.3. Патогистологическое исследование печени крыс.

2.4. Биохимические методы исследования.

2.4.1. Определение концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови методом Ендрассика-Грофа.

2.4.2. Определение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови унифицированным методом Райтмана-Френкеля.1.

2.4.3. Определение активности аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке крови унифицированным методом Райтмана-Френкеля.

2.4.4. Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-ГТП) в сыворотке крови унифицированным колориметрическим методом.

2.4.5. Определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови унифицированным методом.

2.4.6. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом.

2.4.7. Определение концентрации пировиноградной кислоты (ПВК) в сыворотке крови модифицированным колориметрическим методом Умбрайта.

2.4.8. Определение концентрации молочной кислоты в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом.

2.4.9. Определение содержания общего белка в сыворотке крови.

2.4.10. Определение содержания альбумина в сыворотке крови.„.

2.4.11. Определение белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом Олла и Маккорда в модификации С.А. Карпюка.

2.4.12. Определение содержания общего холестерина (ОХС) в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом.

2.4.13. Определение содержания холестерина липротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом.

2.4.14. Определение содержания триацилглицеринов в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом.

2.4.15. Определение концентрации ХС ЛПОНП и ХС ЛПНП в сыворотке крови расчетным методом.

2.4.16. Определение содержания эфиров холестерина (ЭХС) и неэтерифицированного холестерина (НЭХС) в сыворотке крови.

2.4.17. Использование коэффициентов атерогенности для оценки патологии липидного обмена в условиях токсического поражения печени.

2.4.18. Определение содержания ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) в сыворотке крови.

2.4.19. Определение активности супероксиддисмутазы

СОД) в гемолизате эритроцитов.

2.4.20. Определение активности каталазы в гемолизате эритроцитов.

2.4.21. Определение содержания гемоглобина (НЬ) в гемолизате эритроцитов гемиглобинцианидным методом.

2.5. Методика исследования липидов эритроцитов методом высокоэффективной тонкослойной хроматогафии (ВЭТСХ).

2.5.1. Экстракция липидов из эритроцитов.

2.5.2. Фракционирование общих липидов эритроцитов.

2.5.3. Фракционирование фосфолипидов эритроцитов.

2.6. Методы извлечения и изучения химических свойств липидов из продуктов растительного происхождения с предполагаемыми гепатопротективными свойствами.

2.6.1. Определение йодного числа в липидных экстрактах.

2.6.2. Определение массовой доли неомыляемых липидов в экстрактах.

2.6.3. Определение жирнокислотного состава липидных экстрактов методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ).

2.7. Модельные системы перекисного окисления липидов, применяемые для оценки антиоксидантной активности исследуемых продуктов растительного происхождения в опытах in vitro.

2.7.1. Приготовление липосом.

2.7.2. Определение содержания ТБК-РП в суспензии липосом.

2.7.3. Оценка эффективности антиоксидантного действия исследуемых продуктов растительного происхождения.

2.7.4. Исследованные в модельных системах in vitro продукты растительного происхождения.

2.8. Статистические методы исследования.

3. БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ МОДЕЛИ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ, ВЫЗВАННОГО ВВЕДЕНИЕМ ЧЕТЫРЕХХЛОРИСТОГО УГЛЕРОДА.

3.1. Маркеры нарушений функции печени и активности патологического процесса.

3.2. Морфологические изменения паренхимы печени, возникающие при введении лабораторным животным тетрахлорметана.

3.3. Интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления и состояние ферментов антирадикальной защиты крови при' моделировании острого токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода.69!

3.4. Особенности изменения параметров липидного обмена у лабораторных животных при моделировании острого токсического поражения печени, вызванного четыреххлористым углеродом.

3.5. Особенности изменения параметров углеводного и белкового обменов у лабораторных животных при моделировании острого токсического поражения печени, вызванного четыреххлористым углеродом.

4. АНАЛИЗ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ПРОДУКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРЕДПОЛАГАЕМЫМИ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ.

5. ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ ИССЛЕДУЕМЫХ ПРОДУКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ОПЫТАХ

IN VITRO.

6. КОРРЕКЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ, ВОЗНИКАЮЩИХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ, С ПОМОЩЬЮ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ И ПРЕПАРАТА ФОСФОГЛИВ.

6.1. Выраженность гепатопротекгивных свойств растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив в условиях острого токсического поражения печени.

6.2. Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления и состояние ферментов антирадикальной защиты крови при моделировании острого токсического поражения печени.

6.3. Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на липидный обмен крыс в условиях острого токсического поражения печени.

6.4. Влияние некоторых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на параметры углеводного и белкового обменов крыс с моделью токсического поражения печени.

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "СРАВНИТЕЛЬНАЯ БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РАЗЛИЧНЫХ ГЕПАТОПРОТЕКТОРОВ В УСЛОВИЯХ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ (экспериментальное исследование)"

Актуальность исследования. Печень является барьером на пути всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека [А.Е.Вермель, 2005]. Изменение активности печеночных ферментов (вследствие наследственных энзимопатий, воздействия неблагоприятных экологических факторов и др.) ведет к снижению детоксикационной функции печени. На фоне этого чужеродные вещества могут оказывать значительное воздействие на печень, приводящее к формированию ее токсического поражения [РХ)екепге, ХНеппоп, У.Сапуа, 2004; З.М.БеКап, М.О.Б\уат, Б.ДЛгЬапзЫ, 2004; А.МХИ Bisceglie & а1., 2007; Н.И.Калетина, 2008; В.С.Камышников, 2009].

Неблагоприятная экологическая обстановка, опасность химического загрязнения окружающей среды проявляется в прямом и опосредованном токсическом действии на живые организмы значительным количеством веществ техногенного происхождения. Техногенные загрязняющие вещества приводят к возникновению химических реакций в объектах окружающей среды и изменению биохимических реакций, протекающих в организме человека, что приводит к развитию разнообразных патологических процессов [Я.В. Зайцева, О.В.Долгих, Х.В.Нурисламова, 2004; В.Н.Зиновьева, А.А.Спасов, 2005; П.Ф.Забродский и соавт., 2006; 2008; П.Е.Шкодич и соавт., 2006].

В связи с этим, проблема изучения молекулярных механизмов регуляции функциональной активности печени и ее метаболической адаптации к воздействию токсического агента остается важным направлением современной экспериментальной и клинической гепатологии [М.Э. Шубина, О.И. Яхонтова, 2008].

Лечение поражений печени средствами, обладающими антиоксидантными и гиполипидемическими свойствами, широко исследуется в настоящее время [М.М.Ибрагимова и соавт., 2003; 8.Вп11апй,

2004; ХВгок, Ь.ОЬиа, СвШи^ 2005; Н.В.Печерская и соавт., 2006; В.И.Пилипенко и соавт., 2008; В.М.Покровский, О.Г.Компаниец, 2008; Л.В.Кравченко и соавт., 2008]. Особое место в профилактике и лечении гепатитов занимает использование фосфолипидных концентратов и растительных масел, обогащенных ненасыщенными жирными кислотами и жирорастворимыми витаминами [Р.Бте^ 2002; Н.Н.Прозоровская и соавт., 2003; Э.Н.Трушина, О.К.Мустафина, М.Н.Волгарев, 2003; П^Вготошпи, Ь.З.Бгсгерашак, К.БоЬЫп8, 2004; Д.М.Собчак, О.В.Корочкина, 2005; Л.Б.Стрелкова и соавт., 2008; Е.А.Сухосырова, З.К.Никитина, М.Б.Яковлева, 2008; И.В.Шилова и соавт., 2008; В.В.Амосов и соавт., 2009].

Наиболее широкое распространение среди препаратов с гепатопротективными свойствами получили эссенциальные фосфолипиды (ЭФЛ). Механизм их защитного действия связан с восстановлением клеточных мембран гепатоцитов, которые на 2/3 состоят из фосфолипидов. Помимо структурной функции, ЭФЛ участвуют в процессах молекулярного транспорта, делении и дифференцировке клетки, стимулируют активность различных ферментных систем, обладают антиоксидантным действием, замедляют синтез коллагена и повышают активность коллагеназы, что лежит в основе их антифибротического эффекта [В.Д.Белоногова и соавт., 2003; Ю.Л.Шевченко, И.Н.Денисов, Э.Г.Улумбеков, 2003; С.В.Ковалева и соавт., 2003; Н.П.Пальмина и соавт., 2004; С.О.Ключников, 2005; К.ОЬ, 2005; О.И.Киселев и соавт., 2006; Н.И.Гейвандова и соавт., 2008; С.С.Соколовская и соавт., 2008].

Особый интерес представляют гепатопротекторы, получаемые на основе растительного сырья и морских организмов, многие из которых богаты полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), которые необходимы для поддержания жидкостности клеточных мембран, участвуют в адаптации организма к окружающей среде, являются эссенциальными факторами пищи животных и человека, обладают разнообразной биологической активностью [J.Christensen, H.Skou, L.C.Fog, 2001; R.De Caterina, G.Basta, 2001; Albert G., Campos H., 2002; F.B.Hu, L.Bronner, W.C.Willett, 2002; P.C.Calder, 2003; W.W.Koo, 2003; W.Harris, C.von Schacky, 2004; О.К.Нетребенко, 2005, 2008; О.И.Кириллов и соавт., 2006; В.С.Моисеев, 2006, 2008; S.H.Caldwell, C.K.Argo, A.M.Al-Osaimi, 2006; Д.В.Аксенов и соавт., 2007; Е.А.Рожкова и соавт., 2007; Е.А.Абизов, О.Н.Толкачев, 2008; Е.С.Киселева, 2008; А.В.Самойлова и соавт., 2008; В.В.Цуканов и соавт., 2008].

В литературе описаны механизмы действия ПНЖК семейства ю-3, содержащихся в рыбьем жире (эйкозапентаеновая, докозапентаеновая, t докозагексаеновая кислоты), на липидный обмен человека и животных. Большинство авторов пришли к выводу, что регулярный прием рыбьего жира вызывает торможение синтеза триацилглицеринов (ТАГ) в печени, активацию окисления жирных кислот в тканях, снижение уровня холестерина, нормализацию обмена липопротеиновых частиц крови, а < также торможение образования свободных радикалов и активных форм кислорода [C.Camma, S.Bruno, F.Schepis, 2002; Alberti A., Benvegnu L., 2003; A.Alberti, N.Clumeek, S.Collins, 2005; Н.Д.Бунятян и соавт., 2004; В.А.Исаев и соавт., 2004; В.А.Куликов, А.А.Чиркин, 2004; А.Е.Вермель, 2005; Е.Е.Краснова и соавт., 2005; И.Я.Конь и соавт., 2006а, б; В.И.Кузнецов, В.Р.Моррисон, 2006; Т.ПНовгородцева и соавт., 2006; Т.А.Ажунова, С.М.Николаев, В.Г.Банзаракшеев, 2007; С.В.Оковитый и соавт., 2007; Н.В.Перова и соавт., 2007; Е.А.Абизов, О.Н.Толкачев, 2008; Ю.В.Перевалова, П.И.Цапок, 2008].

В современной литературе обсуждаются эффекты как широко известных препаратов природного происхождения на основе фосфолипидов и ТАГ (эссенциале, фосфоглив, эссливер, омакор), так и менее известных (льняное масло, пальмовое масло), содержащих в своем составе ПНЖК, жирорастворимые витамины и другие соединения, нормализующие метаболические процессы в печени и восстанавливающие целостность мембран гепатоциатов [М.М.Джанашия и соавт., 2001; Л.А.Гойкова и соавт., 2004; С.Н.Жаров и соавт., 2005, 2006, 2007а, б; С.В.Оковитый, С.Н.Шуленин, А.В.Смирнов, 2005; С.В.Оковитый и соавт., 2006; Н.Б.Демина и соавт., 2007; Ж.Б.Дашинамжилов и соавт., 2008; С.Н.Жаров, Б.ИСанин, 2009].

Однако, как известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, так и менее распространенные на российском рынке препараты, изучены не в полной мере. В этой связи представляются актуальным исследование по уточнению биохимических механизмов гепатопротекгивного действия известных лекарственных средств, а также обнаружению и исследованию механизма действия новых гепатопротекторов.

Цель исследования: подобрать наиболее эффективные гепатопротекторы растительного происхождения и дать сравнительную биохимическую характеристику выраженности их метаболических эффектов в эксперименте, используя модель токсического поражения печени.

В связи с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:

1. Дать сравнительную биохимическую характеристику выраженности метаболических нарушений, возникающих у экспериментальных животных (крыс), при создании токсического поражения печени, вызванного воздействием четыреххлористого углерода.

2. Провести сравнительное изучение химического состава и физико-химических свойств различных липофильных продуктов растительного происхождения с известными и предполагаемыми гепатопротективными свойствами, используя современные методы количественного анализа.

3. Оценить в искусственно созданных модельных тест-системах in vitro антиоксидантную и антирадикальную активность изучаемых продуктов.

4. Изучить выраженность гепатопротективных свойств исследуемых растительных продуктов у экспериментальных животных, подвергнутых интоксикации четыреххлористым углеродом.

5. Оценить состояние ферментов антирадикальной защиты, активность процессов перекисного окисления липидов, направленность изменений липидного, углеводного и белкового спектров сыворотки крови при экспериментальном токсическом гепатите на фоне приема тестируемых растительных продуктов.

6. С учетом полученных данных дать рекомендации по эффективному использованию различных продуктов растительного происхождения, обладающих гепатопротективными свойствами, для лечения заболеваний печени. j

Научная новизна. Проведен комплексный анализ выраженности нарушений в обмене липидов, углеводов, белков и в системе про-/антиоксиданты, возникающих у экспериментальных животных при моделировании токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода.

В рамках представленного исследования впервые проведено сравнительное изучение липидного состава и физико-химических свойств новых растительных масел (черного и грецкого орехов).

Впервые на большом экспериментальном материале проведено сравнительное изучение антиоксидантной активности различных продуктов растительного происхождения с известными и предполагаемыми гепатопротективными свойствами на доклиническом этапе с применением липосомальной модельной тест-системы. н ц

Впервые доказано наличие гепатопротективных свойств у некоторых растительных масел (черного и грецкого орехов, льняного), исследована выраженность их гепатопротективного эффекта.

Научно-практическая значимость работы. В ходе проведенного исследования изучены растительные масла, обладающие выраженными гепатопротективными свойствами, описан их химический состав и основные метаболические эффекты, что позволяет рекомендовать их для лечения токсического поражения печени у человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Введение в организм лабораторных животных (крыс) четыреххлористого углерода способствует выраженному повреждению мембран гепатоцитов, активации процессов липопероксидации, дисбалансу в работе ферментативного звена антиоксидантной системы организма, нарушению метаболизма липидов, белков, углеводов.

2. Первичный скрининг липофильных продуктов растительного происхождения, основанный на анализе их химического состава и антирадикальной активности в опытах in vitro, является эффективным инструментом для поиска новых гепатопротекторов.

3. Использование льняного масла, масел черного и грецкого орехов, а также препарата фосфоглив для лечения токсического поражения печени способствует снижению интенсивности процессов липопероксидации, нормализации работы ферментов антирадикальной защиты, восстанавливает нарушения липидного, белкового и углеводного обменов, что позволяет рекомендавать исследуемые продукты для лечения токсического гепатита.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на П съезде физиологов СНГ (Кишенев, Молдова, 2008); 15 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Краснодар, 2008); Научно-практической конференции стоматологических кафедр КГМУ «Вопросы организации и образования в стоматологии» (Краснодар, 2009); на Ш съезде физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011).

Сведения о практическом использовании результатов исследования

На основании полученных данных предложены практические рекомендации по использованию результатов исследования в качестве ранних, достоверных диагностических и прогностических тестов для оценки тяжести метаболических нарушений и контроля лечения при остром токсическом поражении печени, а также использованию масел льна, черного и грецкого орехов для комплексного патогенетического лечения больных токсическим поражением печени на кафедре клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России (350063, г.Краснодар, ул.Седина, 4); на кафедре фармации ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России (350063, г.Краснодар, ул.Седина, 4); в ГУЗ «Клинический госпиталь для ветеранов войн» (350063, г.Краснодар, ул. Кирова, 9).

Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций, на теоретических и практических занятиях при обучении студентов, клинических интернов, ординаторов и аспирантов на кафедрах ГБОУ ВПО КубГМУ Минздравсоцразвития России: фундаментальной и клинической биохимии, общей и клинической патофизиологии, клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФПК и ППС, фармации. По результатам исследования опубликовано 13 печатных работ, из них 2 в научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.