Тема 23. Реакция связывания комплемента (рск)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать представление о сущности реакции связывания комплемента, применении ее в ветеринарно-лабораторной практике, получении и подготовке компонентов; освоить методы титрации компонентов для РСК, провести постановку главного опыта. Ознакомить с различными модификациями проведения РСК.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Пробирки в штативах, пипетки на 1,5 мл, резиновые груши, водяная баня с терморегулятором. Компоненты: физиологический раствор, гемолизин (1:100), эритроциты барана (1:40), комплемент (1:20), единый бруцеллезный антиген для РА и РСК, бруцеллезная (позитивная) и нормальная (негативная) сыворотки.

Демонстрационные наборы с результатами: проверки компонентов на антикомплементарность и гемотоксичность; титрования гемолитической сыворотки. Готовая шкала для оценки степени гемолиза эритроцитов. Таблицы по теме.

РСК, как и все серологические реакции, может быть использована в следующих направлениях:

1) для выявления специфических антител в сыворотке крови больных животных с включением в реакцию известного антигена при диагностике бруцеллеза, сапа, листериоза, лептоспироза и др.;

2) для определения в исследуемом материале специфического антигена с использованием известных иммунных сывороток, при диагностике ящура и установления его серотипов и др.

Сущность РСК заключается в том, что при взаимодействии антитела со специфическим для него антигеном происходит процесс связывания комплемента на этом комплексе. Этот процесс не проявляется визуально. Для выявления связывания комплемента к смеси, состоящей из антигена, антитела и комплемента, вводится гемолитическая система, состоящая из гемолитической сыворотки (гемолизина) и эритроцитов барана (рис. 68).

Рис. 68. Схема постановки реакции связывания комплемента: Аг – антиген; Ат – антитело; Эр – эритроциты; Гем. сыв. – гемолитическая сыворотка

Происходит полное связывание комплемента, если взятые для исследования антиген и антитело специфичны, гемолиз не происходит. На дне пробирки после инкубации в течение 20 мин при 37 °С и последующем выдерживании смеси в течение 20-24 ч при комнатной температуре образуется осадок негемолизированных эритроцитов. Если же антиген и антитело неспецифичны и не образуют комплекса, связывающего комплемент, последний остается в свободном состоянии и связывается в гемолитической системе, вследствие чего наступает гемолиз эритроцитов. Исследуемая смесь приобретает красный лаковый цвет, РСК, как и другие реакции иммунитета, протекает при строгих количественных соотношениях, взятых в опыт компонентов и точно оттитрованных количествах комплемента, гемолитической сыворотки, антигена и антител.

Существуют различные модификации реакции связывания комплемента, мы представляем методику постановки РСК при диагностике бруцеллеза. Реакция проходит в водяной бане при 37-38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента – сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

При диагностике сапа и других болезней РСК ставится в объеме 2,5 мл, каждый из компонентов, входящих в реакцию, берется в объеме 0,5 мл.

До проведения главного опыта РСК определяют качество и проводят титрацию всех компонентов, входящих в реакцию.

1. Исследуемые сыворотки и контрольные (позитивная и негативная) разводят физраствором 1:5 или 1:10 и прогревают в водяной бане в течение 30 мин при 56-58°С для разрушения собственного комплемента.

2. Антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК, изготовляемый на биофабрике, представляет собой гомогенную взвесь инактивированных нагреванием и карболовой кислотой бруцелл в физиологическом растворе.

3. Комплемент – нестойкий, легко разрушающийся компонент свежей сыворотки крови всех видов животных. Комплемент – вещество белковой природы, быстро инактивируется при нагревании, под действием света, слабыми растворами щелочей и кислот и др.

В наибольшем и в более постоянном количестве комплемент содержится в сыворотке крови морских свинок, поэтому ее используют в РСК. Кровь у морской свинки берут пункцией из сердца. Взятую в стерильную пробирку кровь ставят на 15-20 мин в термостат, затем кровяной сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенки пробирки, оставляют в покое на 15-20 минут. Сыворотку отсасывают, переносят в чистую пробирку и хранят в холодильнике.

В настоящее время биопредприятия выпускают комплемент в лиофилизированном виде.

Для реакции комплемент разводят в физрастворе и определяют его активность.

4. Эритроциты барана. Кровь от барана (овцы) берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в сосуд с бусами (стеклянными или фарфоровыми), закрытый ватной пробкой и дефибринируют продолжительным встряхиванием.

Полученную кровь центрифугируют при 1500-2000 об/мин, после чего надосадочную жидкость из центрифужной пробирки удаляют, а оставшуюся эритроцигарную массу ресуспензируют в физрастворе и вновь центрифугируют. Эти операции продолжают до тех пор пока жидкость над эритроцитами становится прозрачной. Отмытые эритроциты разводят для реакции физраствором 1:40, т.е. получают 2,5%-ную взвесь эритроцитов.

5. Гемолитическая сыворотка (гемолизин) получают на биопредприятиях путем гипериммунизации кроликов 25 или 50%-ной взвесью эритроцитов в физрастворе. Взвесь эритроцитов вводят роликам внутривенно 4-5 раз с 3-4-дневными интервалами. Через 7 дней после последнего введения у кроликов берут кровь. Получению сыворотку инактивируют 30 мин при 56-58° для разрушения кроличьего комплемента. Гемолизин консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-ным фенолом и разливают по ампулам.

1. Проверка компонентов на антикомплементарность и гемо-токсичность по следующей схеме

Таблица 10

Компоненты	Проверка на
	антиком племен-тарность	гемотоксичность
		компле мента	гемоли зина	антигена	физрас твора
Комплемент в разведении 1:20	0,2	0,2	_	_	-
Гемолизин в рабочем титре	0,2	-	0,2	-	-
Антиген в рабочем титре	0,4	-	-	0,4	-
Эритроциты (2,5%-ная взвесь)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	-	0,6	0,6	0,4	0,8

Водяная баня – 10 мин при 37-38°С.

Результат: Гемолиз. Полная задержка гемолиза.

В реакции используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

2. Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца при использовании каждой новой серии.

Для титрации гемолизина готовят разведения от 1:500 до 1:4000 по следующей схеме:

Таблица 11

Основные разведения гемолизина 1:100, мл	Физиологический раствор, мл	Получаемые разведения
0,4	1,6	1:500
0,1	0,9	1:1000
0,1	1,4	1:1500
0,1	1,9	1:2000
0,1	2,4	1:2500
0,1	2,9	1:3000
0,1	3,4	1:3500
0,1	3,9	1:4000

После приготовления разведений гемолизина приступают к его титрованию по схеме.

Таблица12

Схема титрования гемолизина

Компоненты	Разведение гемолизина
	1:500	1:1000	1:1500	1:2000	1:2500	1:3000	1:3500	1:4000
Гемолизин	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент (1:20)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Эритроциты (2,5%-ная взвесь)	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физраствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 10 мин при 37-38С
Примерный результат	ПГ	ПГ	ПГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ЧГ

Обозначения: ПГ - полный гемолиз; ЧГ - частичный гемолиз

После разлива комплемента в первый ряд пробирок с каждой сыворотки вносят по 0,2 мл антигена в рабочем разведении, а во второй ряд – по 0,2 мл физраствора. Пробирки помещают в водяную баню при 37-38°С на 20 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,4 мл гемолитической системы, встряхивают их, вновь ставят в водяную баню при 37-38°С на 20 мин.

Для приготовления гемолитической системы берется гемолитическая сыворотка в рабочем титре и эритроциты барана в разведении 1:40 в равных частях.

После водяной бани учитывается результат.

Титром гемолизина считают наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза в течение 10 мин при 37-38°С 0,2 мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 мл комплемента, разведенного 1:20. В приведенной таблице титр гемолизина равен 1:1500. Рабочий титр гемолизина для РСК должен быть в два раза выше. Так, если титр гемолизина равен 1:1500, то рабочий титр в РСК будет 1:750.

Титрование комплемента в гемолитической системе

Комплемент титруют в разведении 1:20 в дозах от 0,02 до 0,2 мл с интервалами в дозах по 0,02 мл. После внесения комплемента в каждую пробирку добавляют недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора и остальные компоненты по схеме, как указано в таблице 13.

Титром комплемента в гемолитической системе считают наименьшее его количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 мин в водяной бане при 37-38°С. В примере, приведенном в таблице, титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08.

Схема титрования комплемента в гемолитической системе

Таблица 13

Компоненты	Номера пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Комплемент (1:20)	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Физиологический раствор	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Гемолизин в удвоенном титре	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
2,5%-ная взвесь эритроцитов барана	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Физиологический раствор	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 10 мин при 37-38С
Примерный результат	ЧГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

3. Титрирование комплемента в бактериолитической системе (таблица 14)

Перед постановкой главного опыта РСК проводят титрование комплемента в бактериолитической системе с позитивной (бруцеллезной) сывороткой, негативной сывороткой крови того вида животных, которых исследуют, и одной сыворотке, взятой из исследуемой партии. Каждую сыворотку разводят 1:5 физраствором (1 мл сыворотки+4 мл физраствора) и инактивируют.

Сыворотку разливают по 0,2 мл в два ряда, в каждой из которых по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (в разведении 1:20) в возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой пробирке) количество физраствора.

Точно так же по такой же схеме проводят титрование комплемента в бактериолитической системе с использованием позитивной и одной из исследуемых сывороток. Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное его количество в разведении 1:20, вызывающее полный гемолиз взвеси эритроцитов в разведении 1:40 в пробирках с негативной и исследуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена в течение 20 мин в водяной бане при 37-38С, при задержке гемолиза в пробирках с бруцеллезной сывороткой и антигеном. Определение титра комплемента в бактериолитической системе проводят согласно схеме.

В приведенном примере титр комплемента в этой системе равен 0,10 мл. рабочий титр комплемента для главного опыта на 0,02 мл больше, в данном случае 0,12 мл.

Таблица 14

Схема титрования комплемента в бактериологической системе

Компоненты	Ряд пробирок	Номера пробирок
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Негативная сыворотка 1:5	1	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Антиген в рабочем титр	1	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
	2	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Физраствор	1	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Комплемент в разведении 1:20	1	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
	2	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Недостающее количество физраствора	1	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
	2	0,18	0,16	0,14	0,12	0,10	0,08	0,06	0,04	0,02	-
Водяная баня 20 мин при 37-38С
Гемолитическая система	1	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
	2	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Водяная баня 20 мин при 37-38С
Примерный результат	1	НГ	НГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ
	2	НГ	НГ	ЧГ	ЧГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ	ПГ

Обозначения: ПГ – полный гемолиз; ЧГ – частичный гемолиз; НГ – нет гемолиза

Таблица 15

Схема определения титра комплемента

Сыворотки	Ряды пробирок	Номера пробирок и дозы комплемента, мл
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Позитивная	1	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++	++++
	2	++++	++	+	+	-	-	-	-	-	-
Негативная	1	++++	++	+	+	-	-	-	-	-	-
	2	+++	++	+	-	-	-	-	-	-	-
Исследуемая	1	++++	++++	+++	+++	++	+	+	-	-	-
	2	++++	+++	+	+	-	-	-	-	-	-

Расчет количества неразведенного комплемента, необходимого для главного опыта, делают по формуле

х = АВ : 20,

где х – количество неразведенного комплемента; А – рабочий титр комплемента; В – количество пробирок в опыте; 20 – основное разведение комплемента (3:20).

Пример: х = (0,12 • 100) : 20 = 0,6. Так как количество комплемента в рабочем разведении, требующееся для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 мл (0,2 – 100), то к 0,6 мл неразведенного комплемента следует добавить 19,4 мл физраствора.