644
.pdfФедеральное агентство по образованию
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«Пермский государственный технический университет»
Л.В. Волкова
БИОТЕХНОЛОГИЯ ПРИРОДНОГО АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА И ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ НА ЕГО ОСНОВЕ
Утверждено Редакционно-издательским советом университета
в качестве учебного пособия
Издательство Пермского государственного технического университета
2008
ÓÄÊ 606:615.281.8(075.8) ÁÁÊ 30.16+35.66]ÿ73
Â67
Рецензенты:
директор Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, чл.-корр. РАН В.А. Демаков;
доктор фармацевтических наук, профессор кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии Пермской государственной фармацевтической академии
Е.И. Молохова
Волкова, Л.В.
В67 Биотехнология природного альфа-интерферона и лекарственные формы на его основе: учеб. пособие / Л.В. Волкова. – Пермь: Изд-во Перм. гос. техн. ун-та, 2008. – 161 с.
ISBN 978-5-39800082-5
Рассмотрены особенные свойства природных интерферонов и основные биотехнологические принципы их производства. Особое внимание уделено проблемам совершенствования технологических процессов природного интерферона, перспективам создания различных лекарственных форм на его основе. Показаны преимущества технологии разработанных лекарственных форм по сравнению с существующими. Представлен научно-исследовательский материал по созданию унифицированной технологии производства человеческого лейкоцитарного интерферона, позволяющей получать активную субстанцию в достаточном количестве для изготовления лекарственных форм на его основе. Даны сведения о доклинической оценке различных лекарственных форм. Приведен краткий терминологический словарь.
Предназначено для студентов, магистров, обучающихся по направлению 240100 «Химическая технология и биотехнология», по программе «Промышленная биотехнология и биоинженерия» и по курсу «Биотехнология лекарственных препаратов и GMP» биотехнологических специальностей, и аспирантов высших учебных заведений, в первую очередь биотехнологического профиля. Может быть использовано учащимися школ, лицеев, гимназий, преподавателями биологии, а также специалистами в области биотехнологии лекарственных препаратов, в системах послевузовского образования и повышения квалификации.
ÓÄÊ 606:615.281.8(075.8) ÁÁÊ 30.16+35.66]ÿ73
Издано в рамках приоритетного национального проекта «Образование» по программе Пермского государственного технического университета «Создание инновационной системы формирования профессиональных компетенций кадров и центра инновационного развития региона на базе многопрофильного технического университета»
ISBN 978-5-39800082-5 © ГОУ ВПО «Пермский государственный технический университет», 2008
ОГЛАВЛЕНИЕ |
|
ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................... |
6 |
РАЗДЕЛ I |
|
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ |
|
УНИФИЦИРОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПРИРОДНОГО |
|
АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА |
|
ГЛАВА 1 |
|
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕХНОЛОГИИ |
|
ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНОВ ..................................................................... |
11 |
1.1. Интерфероны и их биологические свойства .............................................. |
11 |
1.2. Современные аспекты технологии |
|
производства интерферона .......................................................................... |
18 |
ГЛАВА 2 |
|
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЕДИНОЙ СИСТЕМЫ |
|
ПОЛУЧЕНИЯ ПРИРОДНОГО АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА ............................. |
31 |
2.1. Подбор оптимальных условий культивирования вируса Сендай ........... |
31 |
2.2. Оптимизация методов очистки |
|
и концентрации вируса Сендай ................................................................... |
38 |
2.3. Разработка условий реакторного культивирования лейкоцитов, |
|
индуцированных вирусом Сендай .............................................................. |
44 |
2.4. Оценка спектра цитокинов, продуцируемых лейкоцитами человека под |
|
действием вируса Сендай............................................................................. |
49 |
РАЗДЕЛ II |
|
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ НА ОСНОВЕ |
|
ПРИРОДНОГО АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА |
|
ГЛАВА 3 |
|
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА, АСПЕКТЫ ИХ |
|
ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ........................................................ |
55 |
3.1. Жидкие лекарственные формы природного интерферона ....................... |
57 |
3
3.2. Мягкие лекарственные формы интерферона ............................................. |
61 |
3.3. Таблетированные формы интерферона ...................................................... |
64 |
ГЛАВА 4 |
|
ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СУППОЗИТОРИЕВ ....................................... |
68 |
4.1. Оценка влияния жировых основ на активность интерферона в |
|
суппозиториях ............................................................................................... |
69 |
4.2.Совершенствование методики экстрагирования интерферона из липофильных основ мягких лекарственных форм интерферона для
контроля противовирусной активности ..................................................... |
79 |
4.3. Оценка стабильности интерферона в жировых |
|
суппозиторных основах ............................................................................... |
82 |
ГЛАВА 5 |
|
ОПТИМИЗАЦИЯ МАЗЕВОЙ КОМПОЗИЦИИ |
|
С ИНТЕРФЕРОНОМ ........................................................................................... |
83 |
5.1. Сравнительная оценка различных мазевых композиций и отработка |
|
технологии приготовления мази с интерфероном..................................... |
84 |
5.2. Разработка методики определения противовирусной активности |
|
интерферона в дифильных мазевых основах ............................................. |
89 |
5.3. Изучение стабильности интерферона |
|
в дифильных основах ................................................................................... |
91 |
ГЛАВА 6 |
|
ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДОСТУПНОСТИ |
|
МАЗИ С ИНТЕРФЕРОНОМ............................................................................... |
96 |
6.1.Сравнительная оценка динамики противовирусной активности интерферона при ректальном
и внутривенном путях введения.................................................................. |
96 |
6.2. Изучение фармакокинетики мази с интерфероном |
|
при введении интраназально и при нанесении на кожу ........................... |
99 |
6.3. Оценка местнораздражающего действия мазевой |
|
лекарственной формы интерферона ......................................................... |
101 |
6.4. Оценка общетоксического действия мази |
|
с интерфероном........................................................................................... |
101 |
ГЛАВА 7 |
|
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ |
|
СУБЛИНГВАЛЬНОЙ ФОРМЫ ИНТЕРФЕРОНА......................................... |
107 |
4
7.1. Обоснование рационального состава и разработка способа |
|
получения сублингвальной таблетки интерферона ................................ |
108 |
7.2. Разработка метода определения противовирусной активности |
|
интерферона в таблетированной форме................................................... |
116 |
7.3. Оценка стабильности специфической активности |
|
интерферона в таблетке в процессе хранения ......................................... |
119 |
ГЛАВА 8 |
|
БИОДОСТУПНОСТЬ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ |
|
СОСТАВЛЯЮЩЕЙ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ФОРМЫ ............................... |
122 |
8.1. Сравнительная оценка динамики всасывания интерферона, |
|
введенного животным орально в форме таблетки и раствора .............. |
122 |
8.2. Доклиническая оценка безопасности интерферона в таблетках ........... |
125 |
8.2.1. Изучение острой токсичности интерферона в таблетках............. |
125 |
8.2.2. Изучение хронической токсичности препарата |
|
интерферона в таблетках при многократном введении |
|
экспериментальным животным ................................................................ |
127 |
8.3. Оценка фагоцитарной активности нейтрофилов у кроликов при |
|
длительном введении интерферона в таблетках ..................................... |
132 |
8.4. Изучение фармакодинамики интерферона у добровольцев |
|
после однократного приема таблетки с интерфероном.......................... |
134 |
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................... |
138 |
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ................................................................ |
139 |
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................... |
149 |
ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ........................................................................................ |
158 |
ВВЕДЕНИЕ
Интерферон (ИФН) – важное звено в адаптационно-приспособитель- ных механизмах макроорганизма и поддержании его гомеостаза. Показано, что биологическая активность ИФН направлена против всех известных РНК- и ДНК-содержащих вирусов. ИФН, являясь продуктом экстренной реакции организма на патоген, продуцируется макрофагами или другими антигенпредставляющими клетками уже при первом контакте с патогеном. При этом формирование устойчивости организма к инфекциям происходит через активацию клеточных реакций намного раньше формирования специфического иммунитета, связанного с антителами.
В процессе интерфероногенеза индуцированные патогеном лейкоциты, наряду с интерфероном, продуцируют широкий спектр цитоки- нов-медиаторов иммунного ответа (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО-, МИФ и ЛИФ), активирующих Т-лимфоциты. Система интерферона представлена ИФН-, - и -. Однако наиболее изучены иммунобиологические и клинические аспекты действия ИФНлейкоцитарного происхождения. Именно этот вид ИФН – природный и рекомбинантный – до настоящего времени широко применяется в профилакти- ческих и терапевтических целях.
Природные препараты ИФН многокомпонентны и содержат все или, по крайней мере, большинство подтипов. Они не обладают антигенными свойствами и не вызывают сенсибилизации при длительном и многократном введении. В то время как рекомбинантные интерфероны, являясь продуктами одного реконструированного гена, всегда однокомпонентны, что обуславливает и соответствующий потенциал их терапевтической активности. Некоторые рекомбинантные ИФН при парэнтеральном введении могут вызывать образование специфических нейтрализующих антител, а также потенцировать различные осложнения.
Разнообразие лекарственных форм лейкоцитарного ИФН- очень важно для практики, учитывая особенности состояния иммунной системы больного и специфику заболевания. Причем местное применение ИФН,
6
когда оно возможно, всегда эффективнее системного. Препараты ИФН для местного применения позволяют локально или внутриорганно воздействовать на патологический процесс, мало влияя на кроветворение.
Лейкоциты крови человека – основные продуценты природного аль- фа-интерферона, количество которых для производственных целей лимитируется донорским сырьем. В связи с этим решение вопросов оптимизации методов культивирования лейкоцитов для повышения выхода целевого продукта и разработки унифицированного эффективного метода получения природного ИФН для создания новых лекарственных форм представляется на сегодня весьма важным и актуальным для практиче- ского здравоохранения.
Эффективной лекарственной формой являются суппозитории с ИФН, способные оказывать как местный, так и системный лечебный эффект за счет выраженной всасывательной способности нижних отделов кишечника. Известно, что при некоторых вирусных поражениях слизистых оболочек и кожи жидкие лекарственные формы ИФН не способны обеспечить поддержание необходимого уровня активации иммунных эффекторов в очаге инфекции. Наиболее приемлема для местного применения на открытых пораженных поверхностях кожи и слизистых мягкая лекарственная форма – интерфероновая мазь.
Âпоследнее десятилетие отмечен интерес и к сублингвальному способу введения белковых препаратов, позволяющему специфической субстанции проникать в организм, минуя протеолитический барьер верхних отделов желудочно-кишечного тракта. Отмечено, что сублингвальная или оральная формы ИФН при лечении вирусных инфекций слизистых оболочек ротовой полости усиливают местный противовирусный иммунитет. В литературе имеются лишь отдельные сообщения о попытке создания пероральных форм интерферона.
Âнастоящее время совершенствование и разработка новых технологических подходов к биотехнологическим продуктам занимает особое место в биотехнологии. Разнообразие лекарственных форм, обладающих широким спектром вирусной, иммуномодулирующей активности, и подбор подходящей к каждому конкретному случаю заболевания определяют основу современной интерферонотерапии.
Âпособии в обобщенном виде представлены данные литературы
èрезультаты многолетних исследований автора по созданию единой унифицированной реакторной технологии для получения субстанции
7
природного -интерферона (гл. 2) как основы для новых лекарственных форм. Основное содержание книги составляют описание технологии разработанных лекарственных форм (гл. 4,5,7) и оценка их биодоступности (гл. 6,8).
Выражаю благодарность коллегам, принимавшим участие в проведении исследовательских работ, и прежде всего профессору О.А. Тимашевой, чл.-корр. РАМН В.Ф. Попову, канд. биол. наук Г.М. Сафоновой, а также д-ру мед. наук А.В. Казьянину, канд. фарм. наук Е.В. Орловой за предоставленную возможность выполнения экспериментальных исследований на базе филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед».
РАЗДЕЛ I БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ УНИФИЦИРОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПРИРОДНОГО АЛЬФА-ИНТЕРФЕРОНА