Основы культивирования вирусных штаммов в биотехнологическом произв

4.Установки непрерывной стерилизации применяют для обеспечения стерильности:

а) воздуха; б) питательных сред;

в) аппарата-культиватора; г) растворов.

5.Наиболее распространенным методом стерилизации питательных сред является:

а) сухожаровой; б) автоклавирование; в) фильтрация; г) кипячение.

Занятие № 2 Семинар на тему «Культивирование вирусных штаммов

и контроль качества с использованием эмбриональных объектов»

Вопросы для проведения семинара

1.Особенности культивирования вирусных штаммов. Отличия условий культивирования бактерий и вирусов.

2.Требования к персоналу, помещениям и посуде при проведении работ по культивированию вирусов.

3.Лабораторные животные, цели и методы их использования в вирусологии.

4.Использование куриных эмбрионов в вирусологии, преимущества перед другими лабораторными животными. Строение развивающегося куриного эмбриона.

5.Требования, которые предъявляют при отборе куриных эмбрионов для заражения вируссодержащим материалом.

6.Методызаражения куриных эмбрионов вирусными штаммами.

7.Методы индикации вирусов в куриных эмбрионах.

8.Гемагглютинирующие свойства вирусов и их использование. Механизм гемагглютинации.

11

9.Принцип, техника постановки и практическое использование РТГА, РГА. Достоинства и недостатки РТГА, РГА.

10.Общие принципы серологических реакций и их использо-

вание.

Список литературы, рекомендуемой для подготовки к занятию

1.Практикум по общей вирусологии / под. ред. И.Г. Атабекова. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Изд-во МГУ, 2002. – 184 с.

2.Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. – 2-е изд., перераб и доп. – М.:

Колос, 2000. – 272 с.

3.Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний / под ред. Э. Леннета, Н. Шмидта. – М.: Медицина, 1974. – 775 с.

4.Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. – М.: Гэотар Медицина, 1999. – 1200 с.

Тест для проверки знаний

1.Пути введения инфекционного материала в полость куриного эмбриона:

а) в аллантоисную полость; б) в амниотическую полость; в) в желточный мешок; г) в подскорлупную оболочку.

2.Основные реакции, используемые для индентификации ви-

русов:

а) РГА; б) ЦПД; в) ПЦР; г) ИФА.

12

3.Качество куриных эмбрионов определяют с помощью: а) ФЭК; б) овоскопа;

в) микроскопа; г) спектрофотометра.

4.Выберите набор компонентов, необходимый для РТГА:

а) вируссодержащий материал, комплемент, эритроциты, физ. раствор;

б) вируссодержащий материал, эритроциты, лизоцим, физ. раствор;

в) иммунная сыворотка, вируссодержащий материал, эритроциты, физ. раствор;

г) эритроциты, вируссодержащий материал, физ. раствор.

5. Реакция торможения гемагглютинации, вызываемой вирусами, используется:

а) для выявления вируса в курином эмбрионе без определения вида;

б) выявления вируса в культуре клеток без определения вида; в) идентификации вируса; г) определения цитопатогенного действия.

Занятие № 3 Семинар на тему «Репродукция вирусных штаммов

для биотехнологического производства в культуре клеточных линий»

Вопросы для обсуждения

1.Типы клеточных культур и клеточных линий, используемых

вбиотехнологии.

2.Требования к качеству культур клеток.

3.Первичные клеточные культуры, особенности культивиро-

вания.

13

4.Заражение и культивирование вирусов в культуре клеток.

5.Выделение вирусов при заражении первичных и перевиваемых культур клеток, тканей животных.

6.Титрование вирусов в культуре клеток.

7.Реакция нейтрализации вирусов на культуре клеток.

8.Статистические методы обработки результатов: подсчет ЛД 50 по Риду и Менчу и др.

9.Люминесцентная микроскопия. Основы иммунофлюоресценции, прямой и непрямой методы, их характеристика.

10.Реакция диффузной преципитации. Основа метода, постановка и учет результатов. Достоинства и недостатки реакции.

Список литературы, рекомендуемой для подготовки к занятию

1.Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний / под ред. Э. Леннета, Н. Шмидта. – М.: Медицина, 1974. – 775 с.

2.Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. – М.: Гэотар Медицина, 1999. – 1200 с.

3.Основы медицинской бактериологии, вирусологии и иммунологии / под ред. Г.М. Шуба. – М.: Логос, 2003. – 264 с.

Тест для проверки знаний

1.Какие клеточные линии используются для определения специфической активности биопродукта:

а) СПЭВ; б) диплоидные;

в) первичные; г) вторичные.

2.Основные этапы приготовления первичной культуры клеток: а) трипсинизация; б) кислотное ферментирование;

в) центрифугирование; г) ультрацентрифугирование.

14

3.Условия выращивания культур: а) охлаждение; б) термостатирование при 37 °С;

в) рН среды роста 5,4–6,7; г) рН среды роста 6,8–7,2.

4.Что обозначает ЛД50:

а) летальная доза, которая убивает 50 % животных; б) эффективная доза, которая защищает 50 % животных от ин-

фекций или интоксикации; в) инфекционная доза, которая заражает 50 % питательных

сред или клеточных культур.

Занятие № 4 Семинар по теме «Производство препаратов специфической

и неспецифической профилактики вирусных болезней»

Вопросы по теме семинара

1.Противовирусные антитела, их свойства, биологическая роль, методы обнаружения и титрования.

2.Интерферон и его роль в противовирусном иммунитете.

3.Принцип получения бактериофагов. Определение активности и практическое использование фагов.

4.Пассивная специфическая профилактика вирусных болезней. Принцип получения гипериммунных сывороток. Контроль сывороток.

5.Специфическая профилактика вирусных инфекций. Виды вакцин и методы их введения.

6.Инактивированные противовирусные вакцины, их получение, свойства, применение и отличия от живых вакцин.

7.Биотехнология получения противовирусных субъединичных вакцин.

8.Факторы противовирусного иммунитета, их характери-

стика.

15

9.Живые противовирусные вакцины, их свойства, применение

иотличия от инактивированных вакцин.

10.Бактериофаги, их значение и основные свойства.

Список литературы, рекомендуемой для подготовки к занятию

1.Инфекционные болезни / Е.П. Шувалова, Е.С. Белозеров, Т.В. Беляева, Е.И. Змушко. – Ростов н/Д: Феникс, 2001. – 960 с.

2.Кипайкин В.А. Рубашкина Л.А. Эпидемиология. – Ростов н/Д:

Феникс, 2002. – 480 с.

3.Основы медицинской бактериологии, вирусологии и иммунологии / под ред. Г.М. Шуба. – М.: Логос, 2003. – 264 с.

Тест для проверки знаний

1. Противовирусная активность ин витро зависит: а) от клеток хозяина;

б) среды, используемой для поддержания зараженной вирусом культуры;

в) дозы вводимого вируса; г) свойств вводимого вирусного материала.

2.Основные модели животных, используемых для испытаний противовирусных препаратов:

а) кролики; б) мыши;

в) куриные эмбрионы; г) морские свинки.

3.Факторы, влияющие на естественное развитие вирусной инфекции:

а) окружающая среда; б) вирус; в) хозяин; г) питание.

16

4.Механизмдействия интерферона нафазырепродукции вируса: а) раздевание; б) синтез ДНК; в) трасляция; г) транскрипция.

5.Адсорбции вирусов на специфических рецепторах чувствительных клеток препятствуют:

а) интерфероны; б) Т-лимфоциты;

в) ингибиторы вирусной активности; г) макрофаги.

Занятие № 5 Решение задач

Решение задач – процесс выполнения действий или мыслительных операций, направленный на достижение цели, заданной в рамках проблемной ситуации – задачи; является составной частью мышления. С точки зрения когнитивного подхода процесс решения задач является наиболее сложной из всех функций интеллекта и определяется как когнитивный процесс более высокого порядка, требующий согласования и управления более элементарными или фундаментальными навыками.

Номер задачи определяется по последней цифре номера зачет-

№ 1. Одним из критериев качества питательной среды, используемой для культивирования клеточных линий, является ин-

17

декс пролиферации, который должен быть не менее 4. Известно, что нагрузка клеток для достижения монослоя на матраце составляет 50 000 клеток в 1 мл (кл./мл), объем питательной среды – 60 мл. При отслаивании клеток с матраца лаборант ресуспендировал их в 10 мл питательной среды. Во всей камере Горяева насчитали 1328 клеток.

Оценить, пригодна ли данная серия питательной среды для технологического процесса препарата «Интерферон».

Для расчета использовать формулу К = А · 1110 · В,

где К – общее количество клеток во флаконе; А – количество клеток во всей камере Горяева; В – объем ресуспедированной взвеси во флаконе (мл); 1110 – коэффициент пересчета с учетом объема камеры Горяева 0,9 мм3 и количества мм3 в 1 мл – 1000.

№2. Для определения специфической активности противовирусных препаратов используют чувствительную линию клеток, культивируемую на матрацах. Известно, что на матраце выросло 19 314 000 клеток, которые лаборант ресуспендировал в 10 мл питательной среды. Из них 3 000 000 было перенесено в другой матрац для последующего пассажа. Для определения противовирусной активности исследуемых препаратов клеточную взвесь необходимо засеять на планшеты с нагрузкой 220 000 кл·мл. Необходимо рассчитать количество питательной среды, которое следует добавить

вклеточную взвесь для достижения данной нагрузки.

№3. Произведите расчет количества вируса Сендай на стадии прайминга, если известно, что на 1 млн лейкоцитов должно приходиться 80 ГАЕ.

№4. Для определения концентрации вируса в исходном материале необходимо провести титрование вируса в культурах клеток и рассчитать титр вируса. Укажите расчет титра вируса по методу Рида – Менча и методу Кербера.

18

№5. Произведите расчет количества вируса болезни Ньюкасла, если известно, что на один лейкоцит должно приходиться 5 вирусных единиц. Укажите состав питательных сред, используемых на данной стадии, и оптимальный объем.

№6. Для культивирования бактериофагов важно соотношение посевной культуры микроорганизмов и маточного бактериофага, вносимых в питательную среду. Оно должно составлять на объем питательной среды: посевной культуры – 5 %, маточного бактериофага – 0,2 %. Рассчитайте, сколько литров посевной культуры

иматочного бактериофага надо взять для засева 500 л питательной среды.

№7. Вам необходимо приготовить вирусный антиген для постановки реакции гемагглютинации, торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента. Укажите основные способы приготовления вирусных антигенов: боратно-солевого, сахарозаацетатного. Как определить титр используемого в реакции антигена вирусов?

№8. Для постановки иммуноферментного метода необходимо получить очищенный вирусный антиген. Укажите основные способы концентрации и очистки вирусных антигенов для постановки ИФА.

№9. Для определения концентрации вируса в исходном материале вам необходимо провести титрование вируса в культурах клеток и рассчитать титр вируса. Укажите расчет титра вируса по методу Рида – Менча и методу Кербера.

№10. Вам необходимо поставить реакцию биологической нейтрализации для определения индекса нейтрализации. Укажите основные этапы этого варианта биологической нейтрализации. Какова особенность метода биологической нейтрализации, регистрируемой по подавлению бляшкообразующей активности вирусов?

19

Занятие № 6 Семинар по теме «Классификация факторов

противовирусного иммунитета»

Вопросы к семинару

1.Неспецифические факторы: основные виды и их значение

впротивовирусном иммунитете.

2.Специфические факторы: клеточный и гуморальный противовирусный иммунитет, их взаимодействие.

3.Факторы неспецифической резистентности при вирусных инфекциях. Особенности фагоцитарной защиты.

4.Антигены. Классификация антигенов.

5.Классы лимфоцитов, дифференциация их в Т- и В-клетки.

6.Структура молекулы антитела, основные свойства антител.

7.Классы антител и их основные функции.

8.Местный секреторный противовирусный иммунитет.

9.Взаимодействие всех факторов противовирусного иммунитета и их единство.

10.Противовирусный иммунитет: врожденный, приобретенный, естественный, искусственный, активный, пассивный.

Список литературы, рекомендуемой для подготовки к занятию

1.Воробьев, А.А., Кривошеин Ю.С., Быков А.С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: учеб. – М.: Высш. шк., 2001. – 224 с.

2.Медицинская микробиология / под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. – М.: Гэотар Медицина, 1999. – 1200 с.

3.Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии. – 2-е изд., перераб и доп. – М.:

Колос, 2000. – 272 с.

20