Принципы и основные методы генетической инженерии. (110

дукты амплификации в этом случае не образуются. Продукты RAPD-ПЦР представляют собой анонимную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами, разной длины. Их выявляют гель-электрофорезом (как присутствие или отсутствие отдельной RAPDполосы). RAPD-маркеры являются высокоинформативной характеристикой для оценки генетического разнообразия и родства. Типичная схема метода RAPD-ПЦР представлена на рис. 11.

Для некоторых RAPD-маркеров установлена связь с генами устойчивости к заболеваниям. На сельскохозяйственных растениях показана возможность использования RAPD-маркеров в селекции на гетерозис: для оценки генетического разнообразия исходных инбредных линий и подбора родительских пар для создания высокогетерозисных гибридов и др. Одним из недостатков RAPD-маркеров является их доминантное (а не кодоминантное) наследование. Считают, что в F2 доминантные маркеры дают в 2 раза меньше информации, чем кодоминантные. Эти недостатки RAPDмаркеров преодолевают с помощью методов, занимающих промежуточное положение между ПДРФ- ПЦР-анализом. Среди них особый интерес представляют AFLP-маркеры.

31

Рис. 11. Схема RAPD-ПЦР

32

5.2. Поиск гомологичных генов

Во всех живых организмах протекают сходные биохимические процессы, катализируемые ферментами, которые ускоряют идентичные химические реакции. Например, как у растений, так и у животных функционирует цикл трикарбоновых кислот, реакции которого катализируют ферменты. Структура этих ферментов у разных организмов может различаться, однако выполняемые ими функции сходны. Такие ферменты, играющие одинаковую роль в метаболизме разных организмов, называют гомологичными. Аналогичное название имеют гены, кодирующие эти ферменты.

Несмотря на то, что структура гомологичных белков может варьироваться, они имеют высококонсервативные участки, входящие в состав каталитических центров. По аналогии с белками существуют консервативные последовательности и в генах.

Если создать праймеры, комплементарные таким консервативным последовательностям, то с помощью ПЦР можно найти гомологичный ген в организме, в котором наличие этого гена неизвестно.

В случае если гомологичный ген в исследуемом организме действительно существует, происходит отжиг праймеров на молекуле ДНК организма. Затем этот участок ДНК, фланкированный (ограниченный) праймерами, амплифицируется. Так, выделив какой-то ген, скажем, из мыши, можно узнать, есть ли подобный ген, а, следовательно, фермент и биохимическая реакция у человека.

Технология ПЦР используется также для определения нуклеотидных последовательностей исследуемых генов).

5.3. Идентификация маркерных генов

Каждый организм имеет уникальные, свойственные только ему гены или другие участки ДНК. Такие последовательности являются маркерными для организма. Если определить наличие маркерного участка, то можно однозначно диагностировать организм. ПЦР позволяет идентифицировать такие маркерные участки генома. В основе лежит все тот же принцип комплементарности праймеров маркерным фрагментам. Если ПЦР имеет положительный результат, значит, маркеры идентифицированы. Следовательно, определен и вид организма.

Этот факт имеет огромное значение в медицинской диагностике. Именно поэтому только в США в 1996 году на ДНК-диагностику было потрачено 181,6 млн долларов. А к 2003 году рост спроса на этот метод прогнозируют до 1400,0 млн.

33

5.4. Применение ПЦР в медицинской диагностике

Полимеразная цепная реакция позволяет оперативно поставить диагноз многих заболеваний. По данным журнала LabMedica прогнозируется развитие пяти основных направлений генодиагностики:

1)диагностика инфекционных заболеваний;

2)диагностика онкологических заболеваний:

–диагностика лейкемий и лимфом;

–диагностика рака груди;

–диагностика других злокачественных заболеваний;

3)диагностика генетических заболеваний;

4)идентификация личности:

–судебная медицина, криминалистика;

–трансплантация органов и тканей;

–определение отцовства;

5)диагностика патогенов в пище.

Главным направлением развития рынка ДНК-диагностики является диагностика инфекционных заболеваний. Если человек страдает заболеванием бактериального или вирусного происхождения, то в его крови обязательно находятся возбудители – бактериальные или вирусные частицы. Любой возбудитель несет маркерные последовательности ДНК, для которых можно сконструировать праймеры. Таким образом, с помощью ПЦР можно определить присутствие того или иного микроорганизма в крови, т.е. поставить диагноз.

В отличие от иммуноферментного анализа, который широко используется для диагностики инфекционных заболеваний, ДНК-диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания, причем в очень низкой концентрации.

Вот лишь некоторые инфекционные заболевания, которые в настоящее время диагностируются с помощью полимеразной цепной реакции.

34

Диагностика рака пока ограничивается небольшим количеством сведений о генах, ассоциированных с этим заболеванием. Для развития успешных методов определения рака необходимы дальнейшие исследования мутаций (в т.ч. в рамках программы «Геном человека»), связанных с канцерогенезом. Вообще название «рак» объединяет большое количество разных заболеваний. В каждом конкретном случае, как правило, неизвестна мутация, приведшая к новообразованию, что существенно затрудняет его диагностику.

Диагностика генетических заболеваний, также как и раковых, может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Однако уже сейчас известны гены некоторых генетических заболеваний, например, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона. Гены подобных заболеваний обычно начинают работать в возрасте после 70 лет. Поэтому их ранняя диагностика позволит заранее начать лечение, которое в этом случае может быть более эффективным.

Идентификация личности – одно из самых перспективных направлений на рынке ДНК-диагностикумов. Это очень быстрый и точный метод. Ежегодный прирост в этом секторе ожидается на 21,3 %.

Сектор рынка ДНК-диагностики патогенов в пище в настоящее время является самым скромным. В настоящее время на ДНК-диагностику микробного загрязнения производимых продуктов питания приходится менее 5 % от общего количества способов, применяемых для тестирования загрязненности продуктов. Однако методы ДНК-диагностики являются, по оценкам экспертов, более быстрыми, точными и информативными, что в ближайшее время приведет к резкому возрастанию доли данного сектора рынка ДНК-диагностики.

35

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Основная литература

1.Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с.

2.Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика / И.Ф. Жимулев. – Новосибирск : Изд-во Новосиб. ун-та, 2002. – 458 с.

3.Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / В.Н. Рыбчин. – СПб. : Изд-во СПбГТУ, 1999. – 521с.

4.Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха [и др.]. – М. :

Высш. шк., 2003. – 469 с.

5.Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Щелкунов. – Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496 с.

Дополнительная литература

1.Баранов В.С. Современное состояние и перспективы генной терапии миодистрофии Дюшенна в мире и России / В.С. Баранов, А.Н. Баранов,

А.В. Зеленин // Генетика. – 2001. – Т. 37. – № 8. – С. 1046–1054.

2.Бурьянов Я.И. Успехи и перспективы генно-инженерной биотехнологии растений / Я.И. Бурьянов // Физиология растений – 1999. – Т. 46. – № 6.

–С. 930–944.

3.Буторина А.К. Картирование генома и обратная генетика // Избранные лекции по курсу «Генетика с основами селекции» : учеб. пособие / А.К. Буторина, О.С. Машкина. – Воронеж : ЛОП ВГУ, 2005. – 67 с.

4.ГинцбургА.Л. Генодиагностикаинфекционныхзаболеваний/ А.Л. Гинцбург // Микробиология, эпидемиология и иммунобиология. – 1998. – № 3. –

С. 86–94.

5.Глеба Ю.Ю. Биотехнология растений / Ю.Ю. Глеба // Соросовский образовательный журнал. – 1998. – № 6. – С. 3–8.

6.Гольдман И.Л. Трансгенные козы в мировой фарминдустрии XXI века / И.Л. Гольдман, С.Г. Кадулин, С.В. Разин // Генетика. – 2002. – Т. 38. – № 1. –

С. 5–21.

7.Гончаренко Г.Г. Основы генетической инженерии / Г.Г. Гончаренко. –

Минск : Высш. шк., 2006. – 183 с.

8.Епринцев А.Т. Методы молекулярно-биологических и генноинженерных исследований : учебно-методическое пособие / А.Т. Епринцев, Е.А Москалев. – Воронеж : ЛОП ВГУ, 2005. – 47 с.

9.Епринцев А.Т. Идентификация и исследование экспрессии генов : учебно-методическое пособие / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин. – Воронеж : ЛОП ВГУ, 2008. – 62 с.

36

10.Ермишин А.П. Генетически модифицированные организмы. Мифы и реальность / А.П. Ермишин. – Минск : Технология, 2004. – 118 с.

11.Генетика / В.И. Иванов [и др.]. – М. : Академкнига, 2006. – 638 с.

12.Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений / Н.В. Кучук. – Киев : Наукова Думка, 1997. – 152 с.

13.Куликов А.М. Генетически-модифицированные организмы и риски их использования / А.М. Куликов // Физиология растений. – 2005. – Т. 52. –

№1. – С. 115–128.

14.Лутова Л.А. Генетическая инженерия растений: свершения и надежды / Л.А. Лутова // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. –

№10. – С. 10–17.

15.Лутова Л.А. Биотехнология высших растений / Л.А. Лутова. – СПб :

Изд-во СПб. ун-та, 2003. – 228 с.

16.Машкина О.С. Генетическая инженерия лесных древесных растения /

О.С. Машкина, А.К. Буторина // Генетика. – 2003. – Т. 39. – № 3. – С. 309–317.

17.Машкина О.С. Генетическая инженерия и биобезопасность. Избранные лекции по курсу «Генетика с основами селекции» : учеб. пособие / О.С. Машкина, А.К. Буторина. – Воронеж : ЛОП ВГУ, 2005. – 72 с.

18.Молекулярная биология клетки / Б. Албертс [и др.]. – М. : Мир, 1994. –

Т. 1. – с. 253–348, 485–502; Т. 2. – с. 93–253.

19.Мюллис К.Б. Необычная история о том, как родилась полимеразная цепная реакция / К.Б. Мюллис // В мире науки (Scientific American). – 1990. – июнь – № 6. – С. 121–133.

20.Падутов В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. – Минск : Юнипол, 2007. – 176 с.

21.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений / Э.С. Пи-

рузян. – М. : Наука, 1988. – 304 с.

22.Романов Г.А. Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности / Г.А. Романов // Физиология растений. – 2000. –

Т. 47. – № 3. – С. 343–353.

23.Семенова М.Л. Зачем нужны трансгенные животные / М.Л. Семенова // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7. – № 4. – С. 13–20.

24.Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг. – М. : Мир, 1998. –

Т. 1. – 373 с.; Т. 2 – 391 с.

25.ФавороваО.О. Лечениегенами– фантастикаилиреальность? / О.О. Фаворова // Соросовский образовательный журнал. – 1997. – № 2. – С. 21–27.

26.Хицова Л.Н. Введение в судебную биологию : учеб. пособие / Л.Н. Хицова, В.Н. Попов. – Воронеж : ЛОП ВГУ, 2007. – 58 с.

27.Boehringer Mannheim. PCR applications manual / Boehringer Mannheim // Biochemica. – 1995. – 125 p.

28.Ehrlich H.Α. PCR Technology: Principle and Applications for DNA Amplification / Н.А. Ehrlich. – Stockton Press, USA, 1989. – 386 p.

37

29.Molecular biology of the cell / B. Alberts [et. al.]. – New York ; London : Garland Publishing Inc., 1994. – 1294 p.

30.Mullis K.Β. The Polymerase Chain Reaction / K.Β Mullis, F. Ferre, R.A. Gibbs. – Birkhauser Boston, USA, 1994. – 205 p.

31.Newton C.R. PCR. / C.R. Newton, А. Graham. – Oxford : BIOS Scientific Publishers Ltd., 1994. – 227 p.

38