Физиология растений (110
..pdf
Заложить опыт по работе 4.1 и 4.4, а затем выполнять работ по порядку их расположения.
3.1. ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЖИВОГО И МЕРТВОГО ПРОТОПЛАСТА ДЛЯ КЛЕТОЧНОГО СОКА
Вырезать из очищенной красной свеклы 12 кусочков мякоти длиной 15-20 мм, шириной и толщиной 5-7 мм. Промыть их водопроводной водой для удаления пигментов поврежденных клеток. Поместить по 3 кусочка в четыре пробирки и залить растворами, согласно вариантам опыта (табл. 2). Одну из пробирок с водой прокипятить в течение одной минуты. Все пробирки оставить стоять на 1 ч, после чего отметить окраску жидкости в пробирке.
Оформление результатов опыта
1) Заполнить таблицу 2.
Таблица 2
Окраска жидкости
№ пробирки |
|
Вариант опыта |
Окраска жидкости |
|
|
|
|
1 |
Вода |
|
|
|
|
|
|
2 |
Вода + кипячение |
|
|
|
|
|
|
3 |
50% |
этиловый спирт |
|
|
|
|
|
4 |
30% |
уксусная кислота |
|
|
|
|
|
2) Сделать вывод о проницаемости для клеточного сока живого и мертвого протопласта.
3.2. НАКОПЛЕНИЕ КРАСИТЕЛЯ В ВАКУОЛЯХ
Вкаплю «нейтральной красной» под покровное стекло положить кусочек эпидермиса
свогнутой стороны чешуи лука. Через 2 мин раствор красителя отфильтровать и заменить каплей воды. Накрыть покровным стеклом и рассмотреть под микроскопом сначала при малом, а затем при среднем увеличении, просмотр повторить через 15-20 мин.
Обратить внимание, что при первом просмотре окрашен в малиновый цвет весь протопласт. Через 15-20 мин в живых клетках окрашенными оказываются только вакуоли. По концам продолговатых клеток отчетливо видна бесцветная протоплазма. У мертвых клеток цитоплазма и ядро будут окрашенными.
Оформление результатов опыта
1) Сделать рисунки.
11
а) окраска живой |
б) окраска живой клетки |
в) окраска мертвой |
клетки через 1-2 мин |
через 15-20 мин |
клетки. |
2) Какие результаты опыта свидетельствуют об избирательном поглощении веществ протопластом живой клетки и отсутствии этого у мертвой?
3.3. НАБЛЮДЕНИЕ КОЛПАЧКОВОГО ПЛАЗМОЛИЗА
Кусочек эпидермиса лука поместить на предметное стекло в каплю молярного раствора роданистого калия или роданистого аммония. Накрыть покровным стеклом. Через 1015 мин рассмотреть препарат под микроскопом. Обратить внимание на форму плазмолиза, который зависит от проницаемости различных слоёв протопласта.
Оформление результатов опыта
1) Зарисовать клетки с колпачковой формой плазмолиза.
Рис 3.1. Колпачковый плазмолиз
2) По форме плазмолиза сделать вывод о проницаемости различных слоев протопласта для ионов испытывавшейся соли
Задание для самостоятельной работы
1) Ответьте на вопросы.
а) Что такое проницаемость клетки?
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
б) Как называется мембрана, окружающая протопласт?
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
в) Как называется мембрана, окружающая вакуоль?
г) Почему наблюдается колпачковый плазмолиз?
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
Занятие 4. ФЕРМЕHТЫ
12
Цель занятия. Ознакомиться с общим принципом действия, классификацией и сп е- цифичностью ферментов.
Продолжительность – 2 ч.
Ферменты – это специфические биологические катализаторы. Они контролируют скорость различных реакций и, таким путем, регулируют обмен веществ организма в целом. В настоящее время известно свыше 1000 ферментов. Hа основе характера их действия все они, по рекомендации комиссии по ферментам Международного биохимического союза разделены на 6 классов.
1. Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные ферменты). Катализируют окислительно-восстаносительные реакции.
2.Трансферазы (фермены переноса). Катализируют перенос атомных группировок (остатки фосфорной кислоты, аминокислот, аминных и метильных групп) от одного соединения к другому.
3.Гидролазы. Группа ферментов, катализирующих расщепление (гидролиз) разли ч- ных сложных соединений при участии воды на более простые.
4.Лиазы. Катализируют негидролитическое отщепление каких-либо групп от субстрата с образованием двойных связей (или наоборот, присоедтнение групп к двойной связи).
5.Изомеразы. Катализируют преврвщение органических соединений в их изомеры.
6.Лигазы(синтетазы). Катализируют соединение двух молекул, связанных с ращеплением пирофосфатной связи в АТФ или других нуклеозидфосфатах.
Эти шесть классов делятся на подклассы и группы подклассов. Каждый фермент, кроме рабочего названия, имеет рациональное название и шифр из четырех цифр. Первая цифра шифра обозначает класс, вторая – подкласс, третья – группа подкласса, четвертая – конкретный фермент.
Установлено, что каждый фермент в качестве обязательного компонента содержит белок. Ферменты, состоящие только из белка, называются однокомпонентными. Многие ферменты состоят из двух компонентов: белковой части – ферона и небелковой простетической группы – агона.
Специфичность действия фермента определяется его белковой частью – фероном. Группы в молекуле фермента, расположенные в различных участках. но взаимодействующие между собой и ответственные за каталитическую активность, получили название функциональных групп.
Комбинация различных химических группировок в молекуле фермента, благодаря которому осуществляется его каталитическое действие, называют активным центром. Активный центр может включать несколько функциональных групп.
4.1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОГО КАТАЛИЗАТОРА (Н2SO4) И ФЕРМЕНТА (АМИЛАЗЫ)
В начале прошлого века, когда начали изучать явления катализа, резко разграничивали катализаторы живого организма и неорганического мира. Считали, что биокатализаторы, присущие только живой клетке, вне ее не могут проявлять свою активность. Со временем были разработаны методы, позволяющие изучить ферменты, выделенные из живых клеток, и было доказано, что биокатализаторы и катализаторы, характерные для неорган ического мира имеют и общие черты действия и различия.
13
Общее у них – ускорение химических реакций за счет снижения энергии активации, т.е избыточного количества энергии, необходимого для прохождения реакции.
Различие состоит в том, что ферменты имеют более сложное строение, чем неорганические катализаторы, что и обеспечивает высокую степень их специфичности, большую чувствительность и лабильность.
Цель работы. Hа основе проведения опытов установить влияние внешних условий на работу ферментов; различия в действии ферментов по сравнению с неорганическими катализаторами; изучить специфичность ферментов.
Материалы и оборудование. Штатив с пробирками, пипетки, водяная баня с термометром, крахмал 1% раствор, раствор йода в йодистом калии, NaOH 10%, CuSO4 3% раствор, раствор сегнетовой соли, раствор сахарозы.
В работе проводится гидролиз двух углеводов: крахмала и сахарозы.
Все углеводы делятся на моносахариды, олигосахариды, полисахариды. Моносахариды в зависимости от числа атомов углерода, входящих в состав молекулы, разделяются на биозы (2), триозы (3), тетрозы (4), пентозы (5), гексозы (6) и седогептулозы (7). В молекуле сахара, кроме спиртовых групп -ОH, обязательно имеется альдегидная или кетонная группа. Сахара, имеющие альдегидную группу, называются альдозами, имеющими кетонную группу
– кетозами и являются восстанавливающими сахарами.
Альдозы и кетозы с жидкостью Фелинга, при нагревании образуют кирпично-красный осадок закиси меди.
Углеводы, состоящие из 2-10 молекул моносахаридов, называются олигосахаридами. Например, сахароза – это дисахарид, состоящий из остатка глюкозы и остатка фруктозы. Причем альдегидная группа глюкозы использована на связь с фруктозой и поэтому сахароза реакции с жидкостью Фелинга не дает. Мальтоза – это дисахарид, состоящий из двух остатков глюкозы, причем альдегидная группа одной из молекул глюкозы остается свободной и обусловливает реакцию с жидкостью Фелинга.
Полимеры, состоящие из более 10 моносахаридов называются полисахаридами. К числу широко распространенных полисахаридов относится крахмал. Он на 96,1-67,6% состоит из полисахаридов, образующих при полном гидролизе глюкозу. Углеводная часть крахмала представлена двумя полисахаридами – амилозой и амилопектином.
Вмолекуле амилозы остатки глюкозы связаны глюкозидными связями между первым
ичетвертым углеродными атомами и образуют длинную неразветвленную цепочку. В молекуле амилопектина глюкозные остатки соединены глюкозидными связями не только через первый – четвертый атомы углерода, но также и между первым и шестым. В результате амилопектин имеет разветвленную структуру.
Врастениях имеется два фермента расщепляющих крахмал. -амилаза расщепляет
крахмал только в неразветвленной части молекулы и действие ее прекращается, когда расщепление доходит до разветвлений в молекуле амилопектина. -амилаза расщепляет амилопектин до мальтозы всего на 54%. Декстрины, образующиеся под действием -амилазы, гидролизуются -амилазой. Фермент амилаза относится к классу 3. Гидролазы.
Амилаза в большом количестве содержится в прорастающем зерне, слюне и соке поджелудочной железы и катализирует гидролиз крахмала с образованием конечного продукта – дисахарида мальтозы.
Для получения амилазы отвешивают 2 г солода (пророщенные, высушенные и размолотые зерна ячменя). Отмеряют цилиндром 10 мл дистиллированной воды. Переносят навеску солода в фарфоровую ступку, добавляют 2-3 мл воды, растирают пестиком до однородной массы. Переносят растертую массу в пробирку, остатками воды (7-8 мл) смывают
14
остатки в ту же пробирку, пробирку взбалтывают и ставят в водяную баню при температуре 40-50оС для активации фермента. После этого отфильтровывают, осадок из пробирки на фильтр не переносят, это задержит фильтрование.
Для обнаружения крахмала и промежуточных продуктов гидролиза используют слабый раствор йода в йодистом калии. Hа наличие крахмала указывает темно-синяя окраска. Промежуточные продукты гидролиза дают окраску от сине-фиолетового до желтого. Чем короче цепочка образовавшегося декстрина, тем слабее его окраска.
Ход работы. В пробирки наливают по 5 мл субстрата (1% раствор крахмала или раствор сахарозы - согласно варианту). Затем в пробирки добавляют по 1 мл катализатора или дистилированной воды. Пробирки ставят в соответствующие варианту температурные условия. Через 15-20 минут из всех пробирок берут пробы с йодом и проводят реакции с жидкостью Феллинга.
Пробы с йодом проводят следующим образом: из опытной пробирки берут 1 мл жидкости в другую пробирку и капают туда 2-3 капли йода в йодистом калии.
Реакцию с жидкостью Феллинга проводят следующим образом: к 1 мл жидкости из опытной пробирки добавьте 1 мл сегнетовой соли и 1 мл медного купороса и смесь нагрейте.
Полученные результаты заносят в таблицу 3.
|
|
|
|
|
Таблица 3 |
|
|
Пробы с йодом и реакция с жидкостью Фелинга |
|
||||
Варианты |
Температура |
Субстрат |
Катализатор |
Проба с йодом |
Реакция Фелинга |
|
опыта |
ºС |
(Есть/Нет) |
||||
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
1 |
50 |
крахмал |
дистиллированная |
|
|
|
|
|
|
вода |
|
|
|
2 |
50 |
крахмал |
амилаза |
|
|
|
3 |
20 |
крахмал |
амилаза |
|
|
|
4 |
0 |
крахмал |
амилаза |
|
|
|
5 |
100 |
крахмал |
амилаза |
|
|
|
6 |
50 |
крахмал |
Н2SO4 |
|
|
|
7 |
100 |
крахмал |
Н2SO4 |
|
|
|
8 |
50 |
сахароза |
амилаза |
|
|
|
9 |
50 |
сахароза |
Н2SO4 |
|
|
|
10 |
100 |
сахароза |
Н2SO4 |
|
|
|
1)Как влияет температура на гидролиз крахмала под действием амилаз?
2)Какие результаты опытов свидетельствуют о специфичности действия ферментов?
3)Чем отличается действие кислоты от действия ферментов (температура, специфичность)?
15
4.2.Особенности работы ферментов
1)Пользуясь предложенными таблицами, зарисуйте схему взаимодействия фермента
исубстрата.
Рис. 4.1 Схема взаимодействия фермента с субстратом
2) Зарисуйте схематическое строение молекулы крахмала. Укажите место действия альфа и бета-амилаз.
Рис. 4.2.Схема строения молекулы |
Рис. 4.3.Схема действия альфа- |
крахмала |
и бета - амилаз |
Задание для самостоятельной работы
1. Ответьте на вопросы.
а) Почему при высокой температуре фермент не работает?
_______________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
б) Что такое специфичность действия фермента? Чем она объясняется?
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
в) К какому классу ферментов относятся амилазы?
_____________________________________________________________________________
16
г) Чем отличается действие -амилазы от -амилазы?
_______________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
Занятие 5. ИНТЕНСИВНОСТЬ ДЫХАНИЯ
Цель занятия. Освоить метод определения интенсивности дыхания при измерении скорости процесса у прорастающих семян различных культур при разных температурах.
Продолжительность – 2 ч.
Дыхание – это физиологический процесс, в ходе которого химическая энергия органического вещества преобразуется в энергию макроэргических связей АТФ и в дальнейшем тратится на жизнедеятельность растений.
Основным дыхательным материалом являются углеводы. Схематично процесс дыха-
ния в этом случае можно выразить уравнением: |
|
С6 Н12 О6 + 6 О2 |
6 CO2 + 6 Н2О + 687 ккал. |
Скорость процесса дыхания или его интенсивность можно измерить по расходу органического вещества, поглощенному кислороду, выделенным воде и углекислому газу.
С технической точки зрения удобнее проводить учет углекислого газа, и поэтому большинство методов основано на этом принципе.
Часто, особенно когда дыхательным субстратом являются не углеводы, а жиры или белки, более полную характеристику процесса дыхания дает одновременный учет поглощенного кислорода и выделенного углекислого газа.
5.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН (по Бойсен-Йенсену)
Метод основан на учете количества углекислого газа, выделяемого семенами при дыхании. Углекислота поглощается гидроокисью калия по уравнению:
2 КОН + СО2 
К2СО3 + Н2О. Избыток гидроокиси калия оттитровывается соляной кислотой:
КОН + НСl 
КСl + Н2О.
По разности кислоты, пошедшей на титрование опытной и контрольной колбы, определяется количество углекислоты, выделенной семенами.
Методика выполнения. Отвесить 10 г семян, указанных преподавателем и поместить их в марлевый мешочек. В 0,5 л банки, через отверстие в полиэтиленовой крышке, налить по 25 мл 0,025 Н раствора гидроокиси калия. Одна из банок будет контрольной, для учета количества углекислоты, заключенной в ее объеме.
Семена и опытную банку поставить в определенные условия для приобретения ими заданной температуры. Через 15 мин приоткрыть полиэтиленовую крышку и быстро подвесить в банке марлевый мешочек с семенами так, чтобы он не касался гидроокиси калия. Банку вновь поставить в заданные условия на 30 мин. У контрольной банки, приоткрыв крышку имитировать помещение в нее семян. В течение опыта контрольную и опытную банки периодически осторожно встряхивать, разрушая образующуюся на поверхности ги дроокиси калия пленку.
По истечении времени опыта быстро вынуть семена из опытной банки и на это же время приоткрыть крышку в контрольной. Содержимое обеих банок оттитровать через
17
пробку 0,025 Н раствором соляной кислоты до слабо-розового окрашивания, исчезающего от одной капли кислоты. В качестве индикатора перед титрованием добавить 2-3 капли фенофталеина.
Разница в мл кислоты, израсходованной на титрование гидроокиси калия в контрольной и опытной банках (с), соответствует количеству гидроокиси калия пошедшего на связывание выделенной в процессе дыхания углекислоты. Рассчитать сколько мг углекислоты связано с гидроокисью калия: 1 мл 0,025 Н гидроокиси калия содержит 1,4 мг КОН, от-
сюда Т гидроокиси калия – 1,4 мг. |
|
|
|
2 КОН + СО2 |
|
|
К2 СО3 + Н2О. |
(56) |
|
(44) |
|
Основываясь на приведенной реакции и молекулярных весах гидроокиси калия и уг- |
|||
лекислоты устанавливаем, что 56мг КОН может поглотить 44 мг СО2 |
|||
Составляем пропорцию: 2 56 — 44 |
|||
|
|
С 1,4 — Х, |
|
Откуда X |
C 1,4 44 |
мг CO . |
|
|
|||
|
2 56 |
2 |
|
|
|
|
|
Учитывая, что интенсивность дыхания принято исчислять в мг СО2 на 100 г семян в час, полученный результат следует умножить на 20, так как в опыте время 0,5 ч, а вес семян
10 г.
Оформление результатов опыта
1) Запишите результаты опыта и проведите необходимые расчеты.
Объект – семена _________________________
Условия – температура ___________________
Пошло на титрование:
Контрольная колба (а) – НСl (мл)____________
Опытная колба (б) – НСl (мл) ______________
|
С= а — в (мл) |
||
Х= |
С 1,4 44 20 |
мг на 100 г семян в ч. |
|
2 56 |
|||
|
|
||
2) Используя результаты, полученные другими студентами, заполните таблицу 4.
|
|
|
|
Таблица 4 |
Интенсивность дыхания семян в зависимости от температуры |
|
|||
|
(в мг СО2 на 100 г ч) |
|
||
Культура |
|
Температура, °С |
|
|
0 |
20 |
|
37 |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
18
3) Сделайте выводы об изменении интенсивности дыхания в зависимости от температуры.
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
Задание для самостоятельной работы
1) Ответьте на вопросы.
а) В чем сходство и различие процессов дыхания и горения?
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
б) Какое значение, кроме энергетического, имеет окисление веществ при дыхании?
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
Занятие 6. ПИГМЕHТЫ ХЛОРОПЛАСТОВ И ИХ СВОЙСТВА
Цель занятия. Научиться извлекать и разделять пигменты хлоропластов. Ознакомиться с их физическими, химическими и оптическими свойствами.
Продолжительность – 2 ч.
Фотосинтез является самым характерным процессом жизнедеятельности растений, основным источником накопления органического вещества и энергии на Земле. В этом процессе из углекислого газа и воды за счет энергии света происходит образование органического вещества.
Главная роль в процессе фотосинтеза принадлежит пигментам листа: зеленым – хлорофиллам «а» и «б», желтым – каротинам и ксантофиллам (каротиноидам). Установлено, что донором энергии для фотосинтетических реакций служит хлорофилл «а». Остальные пигменты передают ему поглощенную энергию.
По химической природе хлорофиллы «а» и «б» – сложные эфиры дикарбоновой кислоты – хлорофиллина (1) и двух спиртов: метила (2) и, встречающегося только в растен иях, спирта фитола (3).
Хлорофилл «а» |
Хлорофилл «б» |
COOC20H39 (3) |
COOC20H39 (3) |
MgN4OH30C32 |
MgN4O2H28C32 |
|
19 |
(1) |
COOCH3 (2) |
(1) |
COOCH3 (2) |
Каротиноиды – это непредельные углеводороды с эмпирической формулой С40 Н56. Они обладают ярко выраженными гидрофобными свойствами, сродством к липофильным растворителям.
Ксантофиллы – кислородсодержащие производные каротина. Они имеют от одной до шести гидроксильных групп (–ОH). Основной представитель – лютеин имеет формулу С40H56О2. Имея гидроксильные группы, ксантофиллы обладают гидрофильными свойств ами, легко растворяются в спирте и хуже, чем каротиноиды, в липофильных растворителях.
Материалы и оборудование 1. Hожницы. 2. Ступки с пестиком. 3. Пробирки. 4. Воронки. 5. Бумажные фильтры. 6. Полоски хроматографической бумаги. 7. Пипетки. 8. Цилиндры с бензином закрытые пробкой. 9. Спиртовки. 10. Спички. 11. Спектроскопы. 12.Свежие и сухие листья растений. 13. Кварцевый песок. 14. Этиловый спирт 96%. 15. Дистилированная вода. 16. Щелочь в кристаллах. 17. Соляная кислота 10%.
6.1. ПОЛУЧЕHИЕ СПИРТОВОЙ ВЫТЯЖКИ СМЕСИ
ПИГМЕHТОВ ЛИСТА
Методика выполнения. Живой или высушенный лист растения мелко нарезать в ступку, прибавить немного кварцевого песка и растереть с 3 мл этилового спирта. Продолжая растирать, постепенно добавить еще 5-7 мл спирта. Сильно разбавлять вытяжку не следует, необходимо получить раствор темно-зеленого цвета. Через фильтр, предварительно смоченный этиловым спиртом, отфильтровать полученную вытяжку в пробирку. Полученный фильтрат использовать для последующих опытов.
Оформление результатов опыта
1) Перечислите, какие пигменты листа перешли в спиртовую вытяжку?
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
6.2. РАЗДЕЛЕHИЕ ПИГМЕHТОВ МЕТОДОМ БУМАЖHОЙ ХРОМАТОГРАФИИ (МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА М.С.ЦВЕТА)
Принципы хроматографии впервые были разработаны русским физиологом М.С. Цветом в начале ХХ века. Метод основан на различной адсорбции пигментов на
бумаге и разной растворимости в подвижном растворителе, в данном случае бензине. Бензин, поднимаясь по бумаге, увлекает за собой нанесенные пигменты. Скорость перемещения, а значит, и высота подъема каждого пигмента зависит от сродства его к целлюлозе и растворимости в бензине (липофильный растворитель). Чем лучше растворяется пигмент в растворителе и меньше его адсорбционное сродство к целлюлозе, тем быстрее он передвигается и выше располагается от места нанесения вытяжки.
Методика выполнения. Взять полоску хроматографической бумаги (не руками, за петельку) и нанести на нее вдоль стартовой линии, в виде полосы, спи ртовую вытяжку пигментов. После высыхания вытяжку наносят еще 3-5 раз, пока не образуется ярко-зеленое
20