Tomchuk_POSІB_VET_BІOHІMІJa

2. Якщо сироватка каламутна, зверху може утворитися шар хіломікронів, із-під якого важко відібрати пробу. У такому разі визначення слід повторити, збільшуючи кількість сироватки і відповідно – реактивів. При цьому прозорий шар буде більшим і з нього легше взяти пробу.

Норма. 0,9–1,9 мМ, або 35–75 мг на 100 см3.

Клініко-діагностичне значення. Дослідження холестеролу використовується в комплексі з іншими тестами для визначення характеру гіперліпопротеїнемій. Гіперхолестеролемія зустрічається при механічних жовтяницях, нефриті, нефрозі, гіпотиреозі, авітамінозах. Підвищують рівень холестеролу андрогени, кортикостероїди, адреналін, сульфаніламіди, тіазидні діуретини, антикоагулянти (фториди, оксалати), білірубін. Гіпохолестеролемія спостерігається при туберкульозі, паренхіматозній жовтяниці, гіпертиреозі, анеміях, голодуванні. Знижують рівень холестеролу аспарагіназа, хлорпропамід, хлортетрациклін, колхіцин, галоперидол, канаміцин, інгібітори МАО, неоміцин.

Лабораторна робота 4.17. Визначення концентрації глюкози у біологічних рідинах глюкозооксидазним методом

Принцип методу. Глюкоза у присутності глюкозооксидази окислюється Оксигеном повітря до глюконової кислоти і гідрогену пероксиду. Глюконова кислота у присутності пероксидази вступає в реакцію з фенолом і 4-амінофеназоном з утворенням сполуки черво- но-фіолетового кольору. Інтенсивність забарвлення, що визначається фотометрично, пропорційна концентрації глюкози.

Хід роботи:

Послідовність процедури визначення концентрації глюкози наведена у табл. 4.6.

Проби ретельно перемішують і інкубують не менше 20 хв при 37 ˚С або 30 хв при 15–25 ˚С. Через 5–10 хв після початку інкубації пробірки інтенсивно струшують. Після закінчення інкубації вимірюють оптичну густину дослідних і калібрувальної проб при 490– 540 нм відносно робочого реактиву у 10 мм кюветах.

411

Таблиця 4.6. – Послідовність виконання лабораторної роботи:

Забарвлення проб стабільне впродовж трьох годин після закінчення інкубації при умові запобігання дії прямих сонячних променів.

Розрахунок концентрації глюкози проводять за формулою:

СЕдос 10 , де Екал

С– концентрація глюкози, мМ;

Едос – оптична густина дослідної проби, од. оптичної густи-

ни;

Екал – оптична густина калібрувальної проби, од. оптичної густини.

Норма, мМ: велика рогата худоба – 2,5–3,3 (телята 4,4–4,7); вівці – 2,5–3,5; свині – 2,5–3,9; коні – 3,0–5,0; собаки – 3,3–4,5.

Клініко-діагностичне значення: в патології обміну глюкози ймовірні такі стани, як гіперглікемія й гіпоглікемія. Гіперглікемія – означає збільшення концентрації глюкози в крові порівняно з нормальним рівнем. Гіпоглікемія – це концентрація глюкози в крові нижче нормального рівня. Гіперглікемія може бути панкреатичного і позапанкреатичного (аліментарна, печінкова, гормональна, нервова) походження. Гіпоглікемія виникає за розвитку патології органів травлення, нирок, гіперінсулінемії.

412

Лабораторна робота 4.18. Визначення вмісту сіалових кислот у плазмі крові

Принцип методу. При нагріванні глікопротеїнів плазми з трихлороцтовою кислотою відщеплюються сіалові кислоти, які гідролізуються з утворенням нейроамінової та оцтової кислот. Резорцин у присутності солей купруму дає з нейроаміновою кислотою синє забарвлення.

Хід роботи:

До 0,1 см3 плазми (сироватки) крові приливають 1,0 см3 5 %- го розчину трихлороцтової кислоти, поміщають на 7 хв на киплячу водяну баню для гідролізу, потім охолоджують і фільтрують через паперовий фільтр. До 0,5 см3 прозорого фільтрату додають 0,5 см3 води і 1 см3 резорцинового реактиву, закривають пробками і розміщають на водяну баню ще на 15 хв. Після цього охолоджують, додають 3 см3 екстрагуючого реактиву (2,5 см3 бутилацетату і 0,5 см3 бутанолу), зтрушують та залишають на 15 хв для розшарування фаз. Колір переходить у верхній шар, який відсмоктують і фотометрують при довжині хвилі 575–490 нм проти розчину з резорциновим реактивом.

Розрахунки проводять за калібрувальним графіком. Норма. Вміст сіалових кислот складає 2,0–2,33 мМ.

Клініко-діагностичне значення. Вміст сіалових кислот зро-

стає при різноманітних запальних процесах, а також при пухлинах, інфаркті міокарда, при ураженні легень.

Лабораторна робота 4.19. Визначення вмісту білірубіну в сироватці крові (метод Ієндрашика, Клеггорна та Грофа)

Принцип методу. Під час взаємодії сульфанілової кислоти з натрію нітритом утворюється діазофенілсульфонова кислота, яка дає з кон’югованим (прямим, зв’язаним) білірубіном сироватки крові рожево-фіолетове забарвлення. За інтенсивністю забарвлення визначають концентрацію білірубіну, що дає пряму реакцію. При додаванні до сироватки крові кофеїнового реактиву некон’ю- гований (незв’язаний, непрямий) білірубін переходить у розчин-

413

ний дисоційований стан і з сумішшю діазореактивів також дає рожево-фіолетове забарвлення. Інтенсивність забарвлення є показником концентрації загального білірубіну. За різницею між вмістом загального та кон’югованого білірубіну визначають концентрацію некон'югованого білірубіну.

Реактиви: кофеїновий реактив; 0,9 %-вий розчин натрію хлориду; діазосуміш:

а) діазореактив І;

б) діазореактив II. Перед роботою змішують 10 см3 діазореактиву 1 і 0,3 см3 діазореактиву II.

Матеріал для дослідження. Свіжа сироватка або плазма кро-

ві.

Хід роботи (табл. 4.7):

Для визначення кон’югованого білірубіну проби колориметрують через 5–10 хв після додавання діазосуміші, оскільки при зволіканні в реакцію вступає некон’югований білірубін.

Для визначення загального білірубіну пробу залишають на 20 хв, після чого колориметрують. Надалі забарвлення змінюється.

Вимірювання проводять на фотоелектроколориметрі при λ = 500–560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з товщиною шару 0,5 см, порівнюючи з водою. Від показників, отриманих при колориметруванні загального та кон’югованого білірубіну, відні-мають показник контролю або колориметрують, порівнюючи з ним.

Розрахунок здійснюють за калібрувальним графіком. Знаходять вміст загального і кон’югованого білірубіну. Для визначення рівня некон’югованого білірубіну від показника загального його вмісту віднімають показник кон’югованого білірубіну.

414

Таблиця 4.7. – Послідовність виконання лабораторної роботи:

Примітки.

1.Сироватка не має бути гемолізованою.

2.Перед визначенням білірубіну пацієнту не можна застосовувати препарати або вживати корм, що викликає штучне

забарвлення сироватки (морква тощо), не слід також уводити вітамін С.

3. Для перерахунку міліграм-відсотків (мг/100 см3) у мікромолі на дециметр користуються коефіцієнтом 17,10.

Норма, мкМ: загальний білірубін – велика рогата худоба –

1,71–10,3; вівці 0–6,84; коні – 4–14,5; свині – 0–6,84; кури – 1,71–

6,0; собаки – 0,4–5,4; прямий білірубін – велика рогата худоба – 0;

вівці 0–4,61; коні – 0–6,84; свині – 0–5,13; собаки – 1,03–2,05.

Клініко-діагностичне значення. Визначення вмісту білішу-

біну та його фракцій, а також уробіліногенових тіл має важливе значення в диференційній діагностиці жовтяниць різної етіології. Розрізняють: гемолітичну, паренхіматозну і обтураційну (механікну) жовтяниці.

При гемолітичній жовтяниці гіпербілірубінемія виникає в основному за рахунок непрямого (вільного) білірубіну. В результаті посиленого гемолізу відбувається інтенсивне утворення в ретикуло - ендотеліальній системі непрямого білірубіну із зруйнованих ерит-

415

роцитів. В той же час печінка не здатна до утворення такої значної кількості білірубінглюкуронідів, що і викликає накопичення непрямого білірубіну в крові і тканинах. Відомо, що непрямий білірубін не проходить через нирковий фільтр, тому він у сечі при гемолітичній жовтяниці не зустрічається. У сечі білірубін не виявляється, оскільки прямий білірубін за звичай знаходиться у межах невисоких цифр. Уробіліноїди в сечі в нормі або збільшені, стеркобілін в калі різко збільшений. Цей вид жовтяниці зустрічається при деяких кровопаразитарних захворюваннях (піроплазмоз, бабезіоз, нутталіоз), інфекційних (інфлуенца), при отруєннях гемолітичними отрутами (куколь, соланін).

При паренхіматозній жовтяниці настає деструкція печінкових клітин і їх набряк; порушується екскреція прямого білірубіну у жовчні капіляри (первинний холестаз), він потрапляє безпосередньо у кров, де вміст його значно збільшується, збільшується його вміст і в сечі. Крім того, знижується здатність печінкових клітин синтезувати білірубінглюкуроніди; внаслідок цього кількість непрямого білірубіну у сироватці крові також збільшується. Ураження гепатоцитів супроводжується порушенням їх здатності руйнувати до ди- і трипіролів уробіліноген, який надходить із тонкої кишки. Останній потрапляє у велике коло кровообігу і виділяється нирками із сечею. Стеркобілін в калі на висоті жовтяниці відсутній – кал знебарвлений (ахолічний кал). Збільшення уробіліноїдів у сечі і нормалізація стеркобіліну в калі – сприятлива ознака. Збільшення обох фракцій спостерігається при ураженні паренхіми печінки факторами інфекційного і токсичного характеру: при інфекційній анемії, гострих і хронічних гепатитах, отруєннях вуглецем чотирихлористим, свинцем, діхлоретаном, тривалому застосуванні сильнодіючих лікарських препаратів.

При обтураційній жовтяниці порушено жовчовиділення, що призводить до різкого збільшення вмісту прямого білірубіну в крові (гіпербілірубінемії). Дещо збільшується у крові концентрація і непрямого білірубіну. Різко знижується вміст стеркобіліну в калі. Повна обтурація жовчної протоки супроводжується відсутністю жовчних пігментів у калі (ахолічний кал). Це можливо при закупорці жовчних шляхів каменцями, паразитами.

416

Концентрація білірубіну в сироватці крові дещо зростає під впливом таких препаратів, як фенітоїн, натрію йодат, сульфаніламіди (переважно фракція кон’югованого білірубіну), індометацин, саталон, тимолол, вітамін К. Знижують вміст білірубіну аспірин, вітамін С.

Лабораторна робота 4.20. Тимолова проба

Принцип методу. Імуноглобуліни сироватки крові осаджуються при рН 7,55 тимоловим реактивом. Інтенсивність помутніння, пропорційна вмісту імуноглобулінів і визначається фотоколориметрично.

Хід роботи (табл. 4.8):

Таблиця 4.8. – Послідовність проведення лабораторної роботи:

Вміст пробірок перемішують і залишають на 30 хв при кімнатній температурі. Потім знову перемішують, вимірюють оптичну густину дослідної проби відносно контрольного розчину.

Довжина хвилі 620–660 нм, кювета 10 мм. Величину каламутності вираховують за калібрувальним графіком.

Побудувати криву за даними, що наведені у табл. 4.9.

Клініко-діагностичне значення. Тимолова проба в нормі складає 0–4 од. SH. Вона позитивна при паренхіматозному гепатиті, тоді як у хворих механічною жовтяницею – негативна (однак

417

стає позитивною, якщо процес ускладнюється паренхіматозним гепати-том). Збільшується тимолова проба при цирозі печінки.

Лабораторна робота 4.21. Цинк-сульфатна проба

Принцип методу. Додавання цинку сульфату при рН 6–8 осаджує з сироватки крові переважно імуноглобуліни. Інтенсивність помутніння, яка визначається колориметрично, пропорційна вмісту імуноглобулінів.

Хід роботи:

У пробірку вносять 2 см3 суміші буферного і цинк-сульфат- ного розчинів, 0,02 см3 сироватки, змішують і через 30 хв колориметрують при довжині хвилі 620–660 нм у 5 мм кюветах проти контрольного розчину, який містить 2 см3 буферного розчину і 0,02 см3 сироватки. Концентрацію імуноглобулінів виражають в одиницях каламутності, які розраховують за калібрувальним графіком.

Клініко діагностичне значення. В нормі імуноглобіліни скла-дають 13–19 % від загального протеїну крові. Гіпогаммагло- бул-немія – зниження концентрації γ-глобулінів, яке може бути пов’язано із зниженням продукції антитіл при ураженні імунної системи будь-якої етіології. Гіпергаммаглобулінемія – збільшення конентрації γ-глобулінів, як результат активації імунних реакцій з посиленим синтезом імуноглобулінів. Спостерігають при бактеріальних і вірусних інфекціях, паразитарних захворюваннях, хроніних інфекціях і цирозі печінки.

Лабораторна робота 4.22. Дослідження вмісту гемоглобіну крові гемоглобінціанідним методом

Принцип методу. Взаємодія гемоглобіну з ацетонціангідрином і червоною кров’яною сіллю у лужному середовищі приводить до утворення комплексу оранжевого коліру, концентрація якого прямо пропорційна концентрації гемоглобіну.

Реактиви: трансформуючий розчин, стандартний розчин гемоглобінціаніду.

418

Хід робот:

Перед визначенням ретельно перемішують кров. Відбирають 0,02 см3 крові у чисту пробірку. Потім вносять 5 см3 трансформуючого реактиву, ретельно перемішують і через 10 хв вимірюють оптичну густину на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 500–560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з товщиною шару 10 мм відносно контрольної проби – дистильованої води, оскільки екстракція води практично дорівнює екстинції трансформуючого реактиву. Концентрацію гемоглобіну визначають за калібрувальним графіком.

Лабораторна робота 4.23. Дослідження вмісту оксигемоглобіну (НЬО2) Fe2+

Принцип методу. У разі отримання похідних гемоглобіну (окси-, карбокси-, метгемоглобіну) використовують їх властивості, зокрема те, що оксигемоглобін – нестійка сполука, карбоксигемоглобін – стійка сполука, метгемоглобін – утворюється під дією окиснювачів. Досліджують ці похідні методом спектрального аналізу. Пігменти крові вибірково поглинають промені світла певної довжини хвилі, і світло, що проходить, дає характерні спектри поглинання.

Хід роботи:

У мірний циліндр на 100 см3 вливають 1 см3 дефібринованої крові й розводять дистильованою водою до позначки. Відмічають колір розчину, відбирають у пробірку 10 см3 розчину оксигемоглобіну і закріплюють у щілині спектроскопа. Під час розглядання в спектроскопі видно дві чіткі смуги поглинання в жовто-зеленій частині спектра. Розчин оксигемоглобіну розливають у 5 пробірок приблизно по 10 см3 для отримання інших похідних. Перша пробірка слугує контролем для подальших досліджень.

419

Лабораторна робота 4.24. Дослідження вмісту карбоксигемоглобіну (НЬСО) Fе2+

Принцип методу. Спорідненість чадного газу до гемоглобіну приблизно в 200 разів вища, ніж до Оксигену. Тому навіть за невеликих його концентрацій у повітрі він швидко з’єднується з гемоглобіном.

Хід роботи:

1. У мірний циліндр на 50 см3 наливають 0,5 см3 крові, насиченої карбону (II) оксидом, і доводять дистильованою водою до мітки. Порівнюють колір отриманого розчину карбоксигемоглобіну з кольором оксигемоглобіну. Розчин карбоксигемоглобіну має специфічний малиновий відтінок.

2. У пробірку наливають 10 см3 розчину карбоксигемоглобіну. Досліджують у спектроскопі спектри поглинання карбоксигемоглобіну, порівнюють їх зі спектром поглинання оксигемоглобіну. У пробірки з розчином оксигемоглобіну і карбоксигемоглобіну додають 2–3 крупинки натрію дитіоніту й обережно перемішують. Спостерігають швидкий перехід оксигемоглобіну в гемоглобін за зміною кольору. Колір розчину карбоксигемоглобіну при цьому не змінюється. Порівнюють спектри поглинання після додавання натрію дитіоніту.

3. До 10 см3 розчину карбоксигемоглобіну додають 2–3 краплі розчину таніну. Утворюється осад малинового кольору. Реакцію повторюють з 10 см3 розчину карбоксигемоглобіну. Випадає осад брудно-коричневого кольору.

4. В одну пробірку додають краплю розведеної НЬО2 крові, а в другу – краплю крові, насиченої Карбону (II) оксидом. В обидві пробірки доливають 20 см3 дистильованої води і ретельно перемішують. За великих розведень оксигемоглобін має жовтуватий відтінок, а розчин карбоксигемоглобіну залишається рожевомалиновим.

Клініко-діагностичне значенн

Збільшення вмісту гемоглобіну в крові тварин (плейохро-

мія, гіперхромемія) спостерігається при згущенні крові (діарея,

420