Tomchuk_POSІB_VET_BІOHІMІJa

Гіпоферментемію виявляють при деяких інфекційних захворюваннях, туберкульозі тощо.

Підвищують активність ліпази наркотичні анальгетики, секретин, гепарин; знижують – протамін, важкі метали, хінін, диізопропілфторфосфат, ЕДТА.

Норма. 0–470 нМ/(с·дм3), або 0–28 мкМ/(хв·дм3).

Лабораторна робота 4.8. Визначення активності трансамідинази в сироватці крові уніфікованим методом

Принцип методу. Трансамідиназа каталізує перенесення амідинової групи з L-аргініну на гліцин з утворенням продуктів реакції L-орнітину та гуанідиноцтової кислоти. Ензим також прискорює реакцію перенесення амідинової групи з L-канаваніну на L-орнітин із перетворенням їх на L-аргінін та L-канавалін.

Утворений L-аргінін визначають на спектрофотометрі або на фотоелектроколориметрі за кольоровою реакцією Сакагучі в модифікації Сакате та Люка при λ = 490–500 нм.

Реактиви: фосфатний буфер, розчин 0,14 М (рН = 7,5); буферний розчин канаваніну сульфату, розчин 7,0 мМ; буферний розчин орнітину гідрохлориду, розчин 7,0 мМ; розчин ТХО кислоти; розчин хромогену; розчин N-бромсукциніміду концентрацією 0,1 г на 100 см3; стандартний розчин L-аргініну гідрохлориду.

Матеріал для дослідження. Свіжа сироватка або плазма крові. Перед проведенням аналізу слід приготувати такі реагенти:

1. Досліджуваний матеріал. У чисту суху пробірку вносять 1 см3 фосфатного буфера та 1 см3 сироватки крові або сечі. Вміст пробірки обережно перемішують.

2.Суміш для проведення реакції.

3.Субстратний розчин – суміш буферних розчинів канаваніну й орнітину.

Хід роботи:

У центрифужні пробірки з дослідними пробами відмірюють по 0,7 см3 субстратного розчину (по 0,35 см3 розчинів канаваніну й орнітину). Вміст пробірок преінкубують на водяній бані при 37 °С протягом 5 хв, потім у дослідні та контрольну проби вносять по

391

0,2 см3 «забуференої» сироватки крові або сечі (0,1 см3 цілісної крові або сечі). Після перемішування проби поміщають у водяну баню при 37 °С, інкубують протягом 1 год. Потім пробірки виймають з бані і в контрольну пробу доливають 0,7 см3 субстратного розчину. Реакцію припиняють додаванням 0,1 см3 розчину ТХО кислоти. Вміст пробірок перемішують. Осад білків відділяють центрифугуванням протягом 10 хв при 3000 об/хв.

З надосадової рідини відбирають 0,5 см3, доводять об’єм водою до 2 см3. При проведенні кольорової реакції до 2 см3 дослідної та контрольної проб добавляють 2 см3 розчину 8-ок- сихіноліну і 1 см3 розчину N-бромсукциніміду. Після перемішування пробірки разом зі штативом ставлять у холодильник для ефективнішого розвитку забарвлення.

Через 20 хв вимірюють оптичну густину дослідних проб на спектрофотометрі при λ = 500 нм або на ФЕК при λ = 490 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з товщиною шару 20 мм (кришку кювети кладуть під її дно). Як розчин для порівняння беруть контрольну пробу.

Активність трансамідинази в сироватці крові та в сечі виражають за кількістю L-аргініну (у мМ або мкМ), що утворився за 1 год інкубації дослідної проби при 37 °С, в розрахунку на 1 дм3 сироватки крові або сечі. Отже, для визначення активності ензиму в мкМ/(дм3·с) отримані за калібрувальною кривою значення (мкМ L-аргініну) необхідно помножити на 20000.

Клініко-біохімічне значення. Підвищують активність вітамін D, золото, саліцилати, амфотерицин В, ампіцилін, цепорин, гентаміцин, ізоніазид, канаміцин, фурадонін, стрептоміцин, сульфаніламіди, рентгеноконтрастні речовини та інші нефротоксичні лікарські препарати.

Норма. У сироватці крові та в сечі активність трансамідинази не визначається.

392

Лабораторна робота 4.9. Визначення вмісту загального протеїну в сироватці (плазмі) крові біуретовим (уніфікованим) методом

Принцип методу. Протеїни сироватки (плазми) крові, реагуючи в лужному середовищі з купруму сульфатом, утворюють сполуки, забарвлені у фіолетовий колір.

Реактиви: натрію хлорид, ч.д.а. або х.ч., ізотонічний розчин 154 мМ; натрію гідроксид, ч.д.а. або х.ч., 0,2 мМ; калію йодид, ч.д.а. або х.ч., розчин калію йодиду 30 мМ в розчині натрію гідроксиду; калію-натрію тартрат 4-х водний (сегнетова сіль), ч.д.а.; купруму сульфат 5-х водний, ч.д.а.

1. Біуретовий реактив: 4,5 г сегнетової солі розчиняють у 40 см3 розчину натрію гідроксиду 0,2 М, додають 1,5 г купруму сульфату та 0,5 г калію йодиду і розчиняють. Доливають до 100 см3 0,2 М розчин натрію гідроксиду. Реактив стабільний при зберіганні його в посуді з темного скла.

2.Робочий розчин біуретового реактиву: 20 см3 біуретового реактиву змішують з 80 см3 0,5 %-го розчину калію йодиду. Розчин стабільний.

3.Калібрувальний розчин альбуміну (із сироватки крові

людини): 100 г/дм3 розчин альбуміну в розчині натрію хлориду

154 мМ.

Матеріал для дослідження. Сироватка крові. Хід роботи:

Дослідна проба: до 0,1 см3 сироватки додають 5 см3 робочого розчину біуретового реактиву і перемішують, уникаючи утворення піни. Через 30 хв (і не пізніше ніж через 1 год) вимірюють екстинкцію на фотометрі в кюветі з товщиною шару 1 см при довжині хвилі 500–560 нм (зелений світлофільтр), порівнюючи з контрольною пробою.

Контрольна проба. До 5 см3 робочого біуретового реактиву доливають 0,1 см3 розчину натрію хлориду 154 мМ, далі обробляють як дослідну пробу.

393

Через 30–60 хв вимірюють екстинкцію на фотометрі, як у досліді, порівняно з контрольною пробою. За одержаними даними визначають вміст протеїну за калібрувальним графіком.

Примітка. Вміст загального протеїну підвищений при венозному стазі, знижений у самок у період лактації і в останні місяці вагітності, під час внутрішньовенних вливань.

Клініко-діагностичне значення: Серед патологічних змін вмісту загального протеїну сироватки крові можуть зустрічатися: гіпопротеїнемія – зниження концентрації загального протеїну і гіперпротеїнемія – підвищення концентрації загального протеїну. Гіпопротеїнемія спостерігається при нефротичному синдромі, ентериті, хронічному панкреатиті, екземах, масивних крововтратах, при затримці води в результаті серцевої декомпенсації, значних втратах протеїну з сечею при нефритах, тривалому перебігу запальних захворювань та кахексії. Знижують результати досліджень: тразинамід, іони амонію, проносні препарати.

Гіперпротеїнемія відмічається рідко, наприклад, при хроніних запальних захворюваннях, які супроводжуються дегідратацією організму (діарея, блювання). Підвищують результати досліджень: амінокислоти (при внутрішньовенному введенні), анаболічні стероїди, андрогени, АКТГ, ацетилсаліцилова кислота, бутамід, імізин, інсулін, кортикотропін, кортикостероїди, прогестерон, рентгеноконтрастні препарати, левоміцетин, стрептоміцину сульфат, сульфаніламіди, тетрациклін, бромсульфалеїн.

В патології протеїнів плазми крові прийнято розрізняти такі стани: диспротеїнемію, дефектопротеїнемію та парапротеїнемію.

Норма, г/дм3: велика рогата худоба – 72–86; вівці – 65–75; свині – 70–85; коні – 60–80; кури – 43–60. Плазма крові містить на 2–4 г/дм3 протеїну більше за рахунок фібриногену, якого немає в сироватці. Вміст протеїну в новонароджених нижче, ніж у дорослих: новонароджені 46–70 г/дм3.

394

Лабораторна робота 4.10. Визначення концентрації альбуміну в сироватці крові

Принцип методу. Альбумін утворює в слабкокислому середовищі з індикатором бромкрезоловим зеленим у присутності детергенту забарвлений комплекс, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації альбуміну.

Хід роботи:

Дослідна проба: 0,02 см3 сироватки або плазми крові ретельно перемішують, уникаючи утворення піни, з 2,0 см3 робочого розчину індикатору, витримують 5 хв та фотометрують у кюветі з товщиною робочого шару 5 мм при довжині хвилі 620–630 нм відносно холостої проби.

Холосту пробу ставлять як дослідну, але замість сироватки використовують 0,02 см3 дистильованої води.

Калібрувальну пробу готують як дослідну, але замість сироватки використовують 0,02 см3 калібрувального розчину альбуміну.

Розрахунок вмісту альбуміну проводять за формулою:

CЕдос А , де Екал

С– концентрація альбуміну в сироватці, г/дм3;

А – концентрація альбуміну в калібрувальному розчині

(50 г/дм3);

Едос. – оптична густина дослідної проби; Екал – оптична густина калібрувальної проби.

Клініко-діагностичне значення. Зниження рівня альбуміну в плазмі крові спостерігається при голодуванні, запальних захво - рюваннях, цирозі печінки, злоякісних пухлинах, кровотечах, після видалення шлунка і виходу білка з кров’яного русла: у просвіт кишечнику – при завороті кишок, перитоніті, на поверхню опіків – при значних опіках; із сечею – у хворих з нефротичним синдромом. Підвищення рівня альбуміну в плазмі крові практично не зустрічається, проте якщо виявляється, це може бути пов’язано із

395

зменшенням вмісту води у кров’яному руслі (відносна гіперальбумінемія).

Норма, г/дм3: велика рогата худоба – 38–50; вівці – 40–50; свині – 35–45; коні – 35–50; кури – 31–35.

Лабораторна робота 4.11. Уніфікований метод визначення концентрації сечовини в сироватці крові за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом

Принцип методу. Сечовина утворює з діацетилмонооксимом при наявності тіосемікарбазиду і солей заліза в кислому середовищі забарвлену сполуку. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації сечовини.

Реактиви: трихлороцтова кислота (ТХО к-та) концентрацією 100 г/дм3; діацетилмонооксим, 25 г/дм3, водний розчин; тіосемікарбазид, 2,5 г/дм3, водний розчин; сульфатна кислота концентрована; ортофосфатна кислота, 85 %-вий розчин; феруму (III) хлорид; бензойна кислота концентрацією 2 г/дм3; стандартний (калібрувальний, еталонний) розчин сечовини концентрацією 7 мМ.

Кольоровий реактив: до 30 см3 робочого розчину феруму (III) хлориду добавляють 20 см3 води, 1 см3 розчину (25 г/дм3) діацетилмонооксиму і 0,25 см3 розчину (2,5 г/дм3) тіосемікарбазиду. Кольоровий реактив готують перед використанням.

Матеріал для дослідження. Цілісна кров, сироватка, плазма крові, сеча (профільтрована з добової кількості, розбавлена 1:50 або 1:100 ізотонічним розчином натрію хлориду).

Хід роботи:

Згідно послідовності процедур, зазначених у табл. 4.4. Пробірки закривають алюмінієвою фольгою, вміст перемі-

шують і розміщають у киплячу водяну баню рівно на 10 хв. Потім пробірки швидко охолоджують у потоці водопровідної води. Вимірюють на фотоколориметрі в кюветі з товщиною оптичного шару 10 мм відносно холостої проби при довжині хвилі 510–550 нм.

396

Таблиця 4.4. – Послідовність лабораторної роботи:

Концентрацію сечовини розраховують за формулою:

CЕдос 16,65 , де

Екал

С– концентрація сечовини, мМ;

Едос – оптична густина дослідної проби; Екал – оптична густина калібрувальної проби.

Клініко-діагностичне значення. Підвищується концентрація сечовини в сироватці крові при гломерулонефриті, гломерулосклерозі, хронічному порушенні функції нирок, хронічній непрохідності сечових шляхів, при посиленому розпаді протеїнів (злоякісні новоутворення, інтоксикації) та дегідратації організму. Зменшується концентрація сечовини в сироватці крові при паренхіматозній жовтяниці, цирозі печінки. Збільшується концентрація сечовини у сечі при гіпертиреозі, при згодовуванні надмірної кількості протеїну та гарячкових станах. Зменшується вміст сечовини в сечі при нирковій недостатності і при лікуванні анаболічними гормонами.

Підвищують вміст сечовини в крові амфотерицин В, гентаміцин, тераміцин, допегіт, альдомет, метилдофа, індометацин, індоцид, метицилін, налідоксонова кислота, невіграмон, неграм, неоміцин,

397

сполуки арсену, октадин, санотензин, ісмелін, сполуки меркурію і стибію, тетрацикліни, триамтерен, фурадонін, нітрофурантоїн, фуросемід, лазикс, цепорин. Хімічну інтерференцію дають хлоралгідрат, хлорамфенікол, солі амонію, хлоробутанол, гуанетидин.

Знижують вміст СТГ, глюкоза, похідні тіазиду.

Норма, мМ: велика рогата худоба – 7,14–10,7; вівці – 2,86–

7,14; кози – 3,57–7,14; свині – 3,57–10,7; коні – 3,57–8,57; собаки –

1,67–3,33.

Лабораторна робота 4.12. Визначення концентрації креатиніну в біологічних рідинах

Принцип методу. Креатинін реагує з пікриновою кислотою в лужному середовищі з утворенням забарвлених сполук.

Реактиви: пікринова кислота, насичений розчин; хлористоводнева кислота, розчин 0,1 М; основний стандартний розчин креатиніну концентрацією 10 мМ; натрію гідроксид, розчин 2,5 М.

Матеріал для дослідження. Сироватка крові, сеча. Як консерванти для сечі можна використовувати тимол і толуол.

А. Визначення вмісту креатиніну в сироватці крові за кольоровою реакцією Яффе (метод Поппера)

Хід роботи:

Визначення креатиніну в сироватці крові: 2 см3 сироватки змішують з 6 см3 насиченого розчину пікринової кислоти. Через 5 хв пробірку кип’ятять 15–20 с у водяній бані, потім центрифугують. До 4 см3 центрифугату добавляють 0,2 см3 розчину натрію гідроксиду 2,5 мМ і ретельно перемішують. Іноді після підлужнення розчин мутніє внаслідок випадання фосфатів. У цьому випадку розчин ще раз центрифугують. Потім розчин доводять до об’єму 10 см3 водою. Через 10 хв (і не пізніше ніж через 20 хв) вимірюють екстинкцію в кюветі з товщиною шару 1 см при довжині хвилі 500–560 нм (зелений світлофільтр), порівнюючи з контрольною пробою.

398

Контрольна проба: 3 см3 насиченого розчину пікринової кислоти і 0,2 см3 розчину натрію гідроксиду 2,5 мМ доводять до об’єму 10 см3 водою.

Розрахунок проводять за калібрувальним графіком.

Норма креатиніну в сироватці крові, мкМ: велика рогата ху-

доба – 88,4–177,0; вівці – 106,0–168,0; кози – 88,4–159,0; свині –

141,0–239,0; коні – 106,0–168,0; собаки – 44,2–132,6.

Б. Визначення вмісту креатиніну в сечі

Хід роботи:

У мірній колбі або циліндрі місткістю 10 см3 змішують 0,5 см3 сечі (з добової кількості) із 3 см3 розчину пікринової кислоти. Суміш ретельно струшують і додають 0,2 см3 розчину натрію гідроксиду 2,5 М. Витримують при кімнатній температурі протягом 10 хв. Доводять об’єм до 100 см3 водою. Вимірюють екстинкцію на фотометрі в кюветі з товщиною шару 1 см при довжині хвилі 500 –600 нм (зелений світлофільтр) проти хо лостої проби.

Холоста проба: 3 см3 розчину пікринової кислоти і 0,2 см3 розчину натрію гідроксиду 2,5 М доводять до об’єму 100 см3 водою.

Розр а х ун ок проводять за формулою при порівнянні з калібрувальною пробою.

Калібрувальна проба: до 0,5 см3 основного калібрувального розчину додають 3 см3 розчину пікринової кислоти і 0,2 см3 розчину натрію гідроксиду (2,5 М). Надалі проби обробляють так само, як дослідні.

К= Ск · Ед · а/Ек ·б, де

К– кількість креатиніну в добовій сечі, мкМ; Ск – кількість креатиніну в калібрувальній пробі, 50 мкМ; Ея – екстинкція дослідної проби; Ек – екстинкція калібрувальної проби; а – добова кіль-

кість сечі; б – кількість сечі, взятої для аналізу.

399

Клініко-діагностичне значення. Підвищення концентрації креатиніну у сироватці крові при гломерулонефриті, гломерулосклерозі, хронічній нирковій недостатності, закупорці сечових шляхів, кишковій непрохідності, діабеті, механічній жовтяниці, гіпофункції наднирників, голодуванні, м’язовій атрофії, зіпертиреозі. Зменшення концентрації креатиніну у сироватці крові може мати місце при застосуванні АКТГ.

Збільшення вмісту креатиніну у сечі відмічається при посиленій м’язовій роботі, гарячкових станах та функціональній недостатності печінки. Зниження креатиніну у сечі спостерігається при м’язовій атрофії, голодуванні, амілоїдозі нирок, лейкозі та уремії.

Вплив лікарських препаратів. Підвищення рівня креатиніну в сечі викликають кортикостероїди; аскорбінова кислота, метилдофа, нітрофурани, леводопа, глюкоза, фруктоза, фенолсульфофталеїн. Знижують вміст креатиніну в сечі андрогени, анаболічні гормони, тіазидні діуретики.

Норма. Концентрація креатиніну в сечі клінічно здорових високопродуктивних глибокотільних корів становить 5,5–14,0 мМ

(в середньому 10,8±1,5 мМ), у дійних – 9,2–13,7 мМ (11,4± 0,6 мМ).

При нефротичному синдромі вміст креатиніну в сечі зменшується у 87,5–95 % корів, у глибокотільних – до 7,4±0,9; дійних – до 4,4±0,5 мМ. У корів з ознаками гепаторенального синдрому концентрація креатиніну в сечі становить 5,0–6,0 мМ. Відношення між вміст креатиніну в сечі і крові – концентраційний індекс (КІ) креатиніну – характеризує концентраційну функцію нирок:

КІ = креатинін у сечі (мМ) : креатинін у крові (мМ).

У людей концентраційний індекс перевищує 60. Величина його у сухостійних корів, хворих на жирову гепатодистрофію,

зменшується до 27,6±3,0 (13,6±45,4) проти 66,2±9,9 (36,0–90,0) – у

клінічно здорових. У дійних корів цей показник ще менший і становить 23,4±2,0 (6,4–48,7) проти 72,7±5,9 (51,0±99,7) – у клі-

нічно здорових. Про порушення концентраційної функції нирок

400