Tomchuk_POSІB_VET_BІOHІMІJa

фракції білірубіну моноглюкуроніду+ білірубіну моноглюкозиду і білірубіну диглюкуроніду. Подальші дослідження рівня білірубіну та його похідних у вмісті порожньої кишки хворих щурів показали, що тенденція відносно їхніх кількісних змін є схожою з описаною у печінці.

Дослідження вмісту білірубіну та його похідних у калі щурів доповнили картину ознак наявності розладів у пігментному обміні як на рівні печінки, так і кишечнику, що проявляється затримкою в організмі більш токсичної фракції білірубіну, недостатнім утворенням кон’югатів білірубіну з сульфатною кислотою і порушенням ферментативних процесів перетворення білірубінглюкуронідів на кінцеві продукти цього обміну – уробіліну й стеркобіліну при одночасному наростанні рівня кон’югатів з глюкуроновою кислотою – білірубіну моноглюкуроніду і білірубіну диглюкуроніду. Отже, отримані результати свідчать про суттєві розлади у перетворенні білірубіну в організмі щурів, хворих на токсичний гепатит.

У результаті токсичного впливу на печінку щурів лінії Wistar препарату диклофенак встановлено розвиток хронічного запального процесу, який проявляється реактивним лейкоцитозом із зрушенням ядра нейтрофілів праворуч, моноцитопенією на тлі компенсаторного прояву лімфоцитозу, суттєвим підвищенням рівня ШОЕ і величини тимолової проби (рис. 3.19).

Поряд із цим, у тварин при ураженні печінки диклофенаком встановлено еритроцитопенію, яка є ознакою анемії, хоча вміст у крові гемоглобіну на етапі дослідження зберігається в межах контрольного діапазону. Останнє вказує на компенсаторну реакцію зі сторони червоного кісткового мозку у відповідь на розвиток токсичного ураження печінки. Без змін залишаються реологічні властивості крові, про що свідчить стабільність величини гематокриту в тварин дослідної групи.

Опиана біологічна модель гепатопатолоії характеризується чітко вираженими клінічними, патолого-анатомічними, гістоморфологічними та біохімічними ознаками токсичного гепатиту.

351

Обладнання, матеріали і реактиви: засоби індивідуального захисту (гумові рукавички, халат та ін. відповідно до вимог техніки безпеки), ваги, шприці, зонди, 5 % розчин диклофенаку.

Хід роботи

1.Проводиться зважування тварин (щурів) та розрахунок дози, необхідної для введення відповідної кількості диклофенаку.

2.Диклофенак у 5 %-ому розчині на бідистильованій воді вводять щурам внутрішньошлунково за допомого зонду в дозі

12,5 мг на кг маси тіла тварини, один раз на добу, впродовж 14 діб. 3. Через 14 діб після введення диклофенаку оцінюють стан

печінки.

352

Контрольні питання

1.Який механізм токсичного впливу диклофенаку на печінку?

2.Які гепатотоксичні наслідки передозування диклофенаку?

3.Які зміни клініко-біохімічного статусу організму щурів від-

буваються при отруєнні диклофенаком?

Рекомендована література

1. Грищенко В. А. Гематологічний профіль у щурів при експериментальному диклофенак-індукованому гепатиті / В. А. Гри-

щенко // Ukrainian Journal of Ecology. – 2017. – т. 7, № 3. – С. 78–83.

2.Використання ліпосом на основі фосфоліпідів молока у гепатології / [Д. О. Мельничук, В. А. Грищенко, В. А. Томчук та ін.]: за ред. Д. О. Мельничука. – К.: НУБіП України, 2010. – 400 с.

3.Мельничук Д.О. Методи дослідження функціонального

стану печінки та біліарної системи: навчальний посібник для підготовки студентів вищих навчальних закладів / Д. О. Мельничук, В. А. Томчук, П. І. Янчук та ін. – К.: НУБіП України, 2015. –

414с.

4.Моделювання медикаментозного гепатиту в лабораторних щурів: матеріали ІV міжнародної наукової конференції студентів

та аспірантів [“Молодь і поступ біології”] (Львів, 7–10 квітня 2008 р.) / О. М. Литвиненко, В. А. Грищенко. – Львів, 2008. –

С. 432–433.

5.Пат. № 105657 Україна. Спосіб моделювання токсичного

гепатиту /Д. О. Мельничук, В. А. Грищенко. А61К31/196, G09В23/ 28. – № u201510370, заявл.23.10.2015; публ.25.03.2016, Бюл. № 6.

6. Сердюков Я. К. Патолого-анатомічні та гістологічні зміни в печінці щурів за медикаментозного гепатиту /Я. К. Сердюков, О. М. Литвиненко, В. А. Грищенко // Современные проблемы токсикологии. – 2008. – № 2. – С. 63–65.

7. Gryshchenko V.A. Biochemical properties of the plasma of rats with the experimentally induced hepatitis after oral administration of sodium diclofenac / V.A. Gryshchenko // Regulatory Mechanisms in Biosystems. – 2017. – 8(2). – Р. 191–196.

353

8. Harirforoosh S. Adverse effects of nonsteroidal antiinflammatory drugs: an update of gastrointestinal, cardiovascular and renal complications / S. Harirforoosh, W. Asghar, F. Jamali // Journal of pharmacy & pharmaceutical sciences: a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutiques. – 2013. – 16(5). – Р. 821–847.

9.Orinya O. A. Haematological and biochemical studies on the effect of diclofenac sodium on Wistar Rattus norvegicus / O. A. Orinya, A. Y. Adenkola, R. J. Ogbe // International Journal of Biological and Chemical Sciences. – 2016. – 10(5), 2231–2242.

10.Ragbetli С. Effects of Diclofenac Sodium on the Rat Liver in Postnatal Period / С. Ragbetli, А. Aydinlioglu, М. Kara [et al.] // Journal

of Animal and Veterinary Advances. – 2009. – 8(9). – Р. 1761–1764.

11.Schapira D. Diclofenac-induced hepatotoxicity / D. Schapira, L. Bassan, A. M. Nahir [et al.] // Postgraduate medical Journal. – 1986.

–62. – Р. 63–65.

12.Syed N. I. Comparing the effects of salts of diclofenac and

alminoprofen with aspirin on serum electrolytes, creatinine and urea levels in rabbits / N. I. Syed, F. Zehra, A. A. Syed [et al.] // Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences. – 2012. – 25(4). – Р. 777–782.

13. Tomic Z. Diclofenac and ketoprofen liver toxicity in rat / Z. Tomic, B. Milijasevic, A. Sabo [et al.] // European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. – 2008. – 33(4). – Р. 253–260.

3.4.5. Моделювання гепатопатології при введенні щурам Кадмію

У зв’язку з інтенсивним розвитком промисловості, у довкіллі значно зріс вміст важких металів. Серед металів-токсикантів – Кадмій, Меркурій, Арсен, Плюмбум, що входять до групи особливо небезпечних екотоксикантів. Широке розповсюдження кадмію у складі корисних копалин, нарівні з його використанням у промисловому виробництві, визначає поступове збільшення вмісту цього елементу в довкіллі (повітрі, грунті, воді). Антропогенне кадмієве навантаження може індукувати комплекс факторів, які здатні викликати порушення практично на всіх рівнях екосистеми і безпо-

354

середньо в організмі людини, як її складової частини. Важкі метали впливають на організм, що призводить до виникнення різноманітних патологічних станів, не лише внаслідок гострої інтоксикації, але й за умов надходження до організму у відносно низьких концентраціях.

Існує три основні шляхи надходження кадмію до організму: через шлунково-кишковий тракт (ШКТ) з харчовими продуктами (кормами) і водою, через легені з повітрям та через шкіру. Кадмій, що потрапляє через легені, легше засвоюється організмом на 10– 30 %. При надходженні через ШКТ, відсоток засвоювання складає лише 4–7 % (0,2–5 мкг Сd за добу). Середньодобова швидкість виведення кадмію з організму незначна, приблизно 0,001 % від його загального вмісту. Повільне виведення кадмію, переважно з сечею, пояснюється відсутністю спряженого з процесами реабсорбції в проксимальних канальцях специфічного біохімічного механізму виведення металу з організму, що забезпечує формування механізмів нефротоксичності без додаткового його надходження.

У результаті перорального поглинання, кадмій абсорбується в кишці, а далі надходить до печінки з портальним кровотоком та інтенсивно поглинається гепатоцитами.

Обмін кадмію в організмі характеризується наступними особливостями:

1)відсутністю ефективного механізму гомеостатичного конт-

ролю;

2)затриманням (кумуляцією) в організмі з тривалим періодом напіввиведення (у середньому 25 років);

3)переважним накопиченням у печінці та нирках;

4)інтенсивною взаємодією з іншими двовалентними метала-

ми як у процесі всмоктування, так і накопичення.

Встановлено, що Кадмій з’єднується з негативно зарядженими групами мембран і, таким чином, модифікує заряд їх поверхні. Одночасно реєструється суттєве збільшення мікров’язкості ліпідної фази мембрани без зміни її полярності. Таку ситуацію пов’язують з тим, що Cd2+ «зшиває» поряд розташовані негативно заряджені групи ФЛ і, таким чином, обмежує їх рухливість.

355

Завдяки наявності ненасичених жирних кислот (ЖК), ФЛ клітинних мембран найбільш схильні до реакції окиснення, що ініціюється вільними радикалами, які утворюються в клітині. Активація процесу утворення вільних радикалів призводить до посилення інтенсивності продукування високореакційних вторинних радикалів, що легко дифундують на значні відстані, та активації ПОЛ.

Важливим механізмом пошкодження біологічних мембран є гідроліз ФЛ внаслідок активації фосфоліпаз (особливо фосфоліпази A2). Результатом дії фосфоліпази А2 на ліпіди біологічних мембран є вивільнення арахідонової кислоти. Остання, в свою чергу, є субстратом циклооксигенази. Перетворення арахідонової кислоти за участі циклооксигенази призводить до утворення ейкозаноїдів (простагландинів, тромбоксанів, простациклінів) – речовин, що активують розвиток запальних процесів у тканинах. Під впливом іншого ферменту (5-ліпоксигенази) арахідонова кислота перетворюється на лейкотрієни та ейкозатетраєнові кислоти. Вони виступають хеміоатрактантами нейтрофілів – речовинами, які регулюють судинну проникність.

Біологічні наслідки дії важких металів на мембрани:

1) у результаті зростання проникності мембран змінюється швидкість надходження іонів та субстратів до клітини та вихід з неї продуктів метаболізму. Це призводить до порушень обміну речовин

уклітині, електричних властивостей мембран;

2)порушується структурна організація та функціональна активність клітини, можлива загибель клітин;

3)утворення ряду активних речовин, які беруть участь у патогенезі токсичного процесу.

Одним з основних механізмів, за допомогою якого більшість важких металів реалізують свою токсичну дію, є активація вільно - радикального окиснення, що супроводжується пошкодженням макромолекул та надмолекулярних комплексів, у т. ч. біологічних мембран. У процеси вільнорадикальних перетворень оксигену можуть втягуватися різноманітні біологічно важливі молекули. Утво - рення продуктів відновлення оксигену в живих системах створює

356

можливість їх взаємодії між собою та іншими молекулами чи іонами, появи токсичних продуктів та запуску патологічних процесів типу ПОЛ.

Процеси ліпопероксидації відіграють важливу роль і в механізмах токсичної дії іонів кадмію. Цей елемент, на відміну від інших важких металів, безпосередньо не генерує в клітинах вільні радикали. Проте, чисельні дані свідчать про генерацію у клітинах супероксидного радикалу, гідроксильного радикалу та NO-радика- лів внаслідок непрямої дії Кадмію. Показана генерація кадмієм гідрогену пероксиду, який стає значним джерелом вільних радикалів внаслідок реакції Фентона. Кадмій може замінити ферум та купрум в ряді білків подібних до ферритину, що, у свою чергу, призводить до збільшення концентрації Fe2+ та Cu2+.

Дослідження прооксидантного ефекту кадмію на клітинах печінки показало, що механізм його індукції ПОЛ пов’язаний з витісненням іонів, які ініціюють окисний процес, з клітинних структур. Крім того, встановлено, що інтоксикація тварин кадмієм сприяє продукції радикалів оксигену в мітохондріях і мікросомах гепатоцитів, а також призводить до зниження вмісту відновленого глутатіону (ВГЛ) у печінці. Отримані подібні результати також свідчать, що під впливом кадмію продукуються радикали оксигену в клітинах. Введення тваринам кадмію хлориду призводить до суттєвої активації ПОЛ у корі великих напівкуль та міокарді, однак при цьому не спостерігається змін в активності антиоксидантних ферментів у вказаних органах.

Проведені дослідження активності ряду ферментів антиоксидантного захисту (АО)-захисту (каталази, Кат; супероксиддис-мутази, Cu,Zn-СОД, Mn-СОД) печінки та нирок після хронічного надходження кадмію з питною водою свідчать про їх чутливість до дії цього елементу. В дослідах in vitro показано, що зниження вмісту ТБК-активних продуктів, внаслідок внесення вітаміну Е, не призводить до відновлення активності ферментів системи АО-захисту в умовах дії кадмію. Вважається, що кадмій зв’язується з імідазольною групою His-74 білкової молекули Кат і це призводить до порушення перебігу реакції розпаду гідрогену пероксиду. Кадмій виступає інгібітором активності Mn-залежної СОД

357

мітохондрій печінки, ймовірно, завдяки заміщенню Mn (II) іонами кадмію. Гостра інтоксикація тварин кадмієм призводить до зростання активності ферментів системи АО-захисту: Cu,Zn-СОД, Кат, глутатіонпероксидази (ГП), глутатіонредуктази (ГР) та глутатіонтрансферази (ГТ). Зокрема, надходження Кадмію до організму тварин викликає значне посилення інтенсивності ПОЛ (підвищується внутрішньоклітинний рівень ТБК-активних продуктів) та пригнічення активності антиоксидантних ферментів (СОД, Кат, ГП, ГР). Активацію вільнорадикального окиснення за дії важких металів пов’язують з виснаженням резерву природних антиоксидантів (аскорбінової кислоти й токоферолу) у клітинах поряд зі зміною активності антиоксидантних ферментів (Кат і СОД).

Відомо, що активні радикали здатні викликати окисну модифікацію не лише ліпідів, але й білків. Найбільш активно піддаються окисним перетворенням триптофан, тирозин, гістидин та цистеїн. Крім того, гідроксильний радикал (·ОН), як правило, викликає агрегацію білків, а у комбінації з О2· та О2 – фрагментацію. Фрагментацію білків здатні також викликати радикали ліпідів. Атакування ·ОН ароматичних та сірковмісних амінокислотних залишків супроводжується їх незворотними змінами. Окисна модифікація ферментів системи АО-захисту призводить до змін їх активності: О2· інгібує активність Кат та ГП; Н2О2 викликає інактивацію СОД та цитохрому Р-450. Таким чином, вільні агресивні радикали впливають на різноманітні структури-мішені клітин: ліпідні мембрани, вільні амінокислоти, полісахариди, рецепторні молекулярні комплекси, транспортні білки тощо (рис. 3.20).

Підсумком цього є зміна функціонального стану клітини, мутація генетичного коду, що на рівні макроорганізму призводить до мутагенезу та новоутворень у віддалені періоди після дії токсиканта, некрозу, лізису клітин та прискоренню апоптозу. Саме тому значної актуальності при кадмієвій інтоксикації організму тварин набувають препарати з мембранотропними властивостями, що стимулюють розвиток репаративних процесів в ушкоджених структурах клітин.

Мітохондрії – найчутливіші до різних токсичних агентів органели, які піддаються структурним і функціональним змінам,

358

чим і пояснюється їхнє дослідження при дії кадмію. За цих умов відмічається порушення активності основних ферментів дихального ланцюга мітохондрій ентероцитів тонкої кишки та гепатоцитів: НАД·Н-КоQ-оксидоредуктази, сукцинат-КоQ-оксидоредукта- зи, КоQ-цитохром с-оксидоредуктази та цитохромоксидази, а також Н+-АТФази.

За умов дії кадмію виникають зміни щодо вмісту ліпідів мітохондріальних мембран (особливо ХС), а також до порушення мікров’язкості анулярних ліпідів і структурної жорсткості білкових молекул. Виявлені конформаційні зміни білкових молекул мітохондріальної мембрани. З іншого боку, функціональні порушення внутрішньої мембрани мітохондрій при дії кадмію пов’язані як з безпосереднім впливом на мембрани, так і з руйнуванням лізосом і виходом лізосомальних ферментів, що призводить до їхньої деградації.

Рис. 3.20. Активація важкими металами вільнорадикальних процесів у клітині та їх наслідки (цит. за Flora S., 2008)

359

Дослідження проводять на безпородних щурах-самцях масою тіла 180–200 г. Тваринам упродовж 14 діб перорально вводять кадмію хлорид в дозі 1,0 мг/кг маси тіла, що відповідає 1/50 ЛД50. Щурів декапітують після закінчення експерименту.

В результаті відмічається дестабілізація ліпідної компоненти мембран, порушення інтенсивності окисних процесів і функціональної активності мембран ентерота гепатоцитів при дії на організм кадмію.

Мета і завдання роботи: отримати модель гепатопатології під дією кадмію на організм щурів; відповісти на контрольні питання.

Обладнання, матеріали і реактиви: засоби індивідуального захисту (гумові рукавички, халат та ін. відповідно до вимог техніки безпеки), ваги, шприці, зонди, 0,1 % розчин кадмію хлориду.

Хід роботи

1.Проводиться зважування тварин (щурів) та розрахунок необхідної для введення дози кадмію хлориду.

2.Кадмію хлорид у 0,1 %-ому розчині на бідистильованій

воді вводять щурам внутрішньошлунково у дозі 1,0 мг на 1 кг маси тіла, що відповідає 1/50 ЛД50 (за разового введення), один раз на добу, впродовж чотирнадцяти діб.

3. Через 14 діб після введення кадмію хлориду оцінюють стан печінки.

Контрольні питання

1.Який механізм токсичного впливу Кадмію на організм?

2.Які гепатотоксичні наслідки передозування Кадмію?

Рекомендована і використана література:

1.Використання ліпосом на основі фосфоліпідів молока у гепатології / [Д. О. Мельничук, В. А. Грищенко, В. А. Томчук та ін.]: за ред. Д. О. Мельничука. – К.: НУБіП України, 2010. – 400 с.

2.Грищенко В. А. Структура мембран ентероцитів та гепато-

цитів щурів за експериментальної ентеропатології та різних способів корекції / В. А. Грищенко, С. В. Хижняк, О. М. Литвиненко [та ін.] // Ветеринарна медицина. – 2009. – № 1. – С. 30–33.

360