Tomchuk_POSІB_VET_BІOHІMІJa

нює також швидку транслокацію Egr-1 із цитоплазми в ядро, де він ефективно зв’язується з відповідними cis-елементами ДНК.

Встановлено низку транскрипційних факторів, що формують протеїнові комплекси з Egr-1, в патогенезі експериментального коліту за допомогою «TranSignal™ Protein/DNA Array». За даними літератури регуляторна активність Egr-1 пов’язана з іншим транскрипційним фактором – Sp1, їх сайти зв’язування частково перекриваються в спільній (-GGGCGG-) ділянці промотора низки генів. Ці транскрипційні фактори можуть конкурувати один з одним за центри зв’язування в промоторній ділянці залежно від їх концентрації в ядрі ендотеліальних клітин. З’ясовано, що за нормальних умов Egr-1 формує стійкий комплекс з Sp1. Розвиток запалення з наступним формуванням ерозій та виразок на фоні експериментального коліту супроводжувався зменшенням вмісту протеїну Sp1 і, відповідно, рівня його взаємодії з Egr-1.

Також показано, що Egr-1 формує протеїнові комплекси з іншими транскрипційними факторами, а саме: PPAR, GAS/ISRE, USF-1, AP-2, NF-E1, NF-E2, NF-κB, MEF-1, Myc-Max, PAR(DR5), E2F1, MRE, TR, GAG, ADR1, GATA-1/2, CREB-BP1, FKHR, рівень взаємодії з якими змінюється залежно від стадії розвитку коліту. В процесі розвитку запалення на фоні коліту найміцніший комплекс формується між Egr-1 та NF-κB. NF-κB бере участь у регуляції експресії генів імунної відповіді та запального процессу і активується при порушенні редокс-гомеостазу клітин та дії прозапального цитокіну TNF-α.. NF-κB вважається центральним прозапальним транскрипційним фактором у патогенезі запальних захворювань кишечнику та з’єднувальним ланцюгом між хронічним виразковим колітом та розвитком колоректального раку.

За нормальних умов Egr-1 формує стійкий протеїновий комплекс з PPAR, який практично не змінюється на фоні розвитку експе-риментального коліту. Відомо, що PPAR відіграє захисну роль у патогенезі запальних захворювань кишечника, а введення тваринам агоністів PPAR значно покращує стан при експериментальному ко-літі за рахунок зниження експресії маркерів запалення, в т. ч. NF-κB. У роботі припускається, що отримана стійка взаємодія між Egr-1 та PPAR за нормальних умов може бути

331

одним із захисних механізмів у патогенезі запальних захворювань кишечнику.

Egr-1 є чутливим до гіпоксії транскрипційним фактором, який запускає експресію низки генів, залучених до реалізації клітинної відповіді на знижен-ня рО2; таких як тканинного фактора, факторів росту, цитокінів/хемокінів та рецепторів адгезії. Крім того, сайт зв’язування з Egr-1 був знайдений в промоторній ділянці гена VEGF, основним регулятором транскрипції якого є HIF-1. Встановлено, що регуляторна активність Egr-1 не залежить від HIF-1 в патогенезі запальних захворювань кишечника.

З метою подальшого з’ясування ролі Egr-1 як можливого патогенетич-ного чинника розвитку уражень при запальних захворюваннях кишечнику проведено порівняння морфологічних ознак експериментального коліту в мишей з гомозиготною (Egr-1-/-) та гетерозиготною (Egr-1+/-) мутацією в гені протеїну Egr-1 та диким типом. Було знайдено, що дефіцит Egr-1 призводить до значного зменшення проявів морфологічних ознак йодоацетамід-зумовле- ного коліту. Отже, активація Egr-1 запускає експресію пошкоджувальних стимулів і є однією із причин розвитку уражень в патогенезі запальних захворювань кишечнику.

Розвиток будь-якого запального процесу складається із двох стадій: гострої та хронічної. В перші години розвитку запального процесу (гостра фаза) спостерігається збільшення проникності ендотеліального шару з наступним підвищенням адгезії до лейкоцитів, активація процесів коагуляції, а на більш пізніх стадіях (фаза хронічного запалення) – формування нових кровоносних мікросудин (ангіогенез). Початкові етапи розвитку запальних захворювань кишечнику характеризуються переважанням гострого запалення, яке поступово переходить у стадію хронічного. VEGF є унікальним фактором, здатним, з одного боку, посилювати проникність кровоносних судин та збільшувати експресію протеїнів адгезії ендотеліальними клітинами, а, з другого боку, стимулювати ангіогенез.

У науковій літературі продемонстровано підвищення експресії протеїну та мРНК VEGF за умов гострого йодоацетамід-зумовле- ного коліту та хронічних спонтанних колітів у IL-10-/- мишей.

332

Імуногістохімічне барвлення стінки товстої кишки виявило, що основним джерелом VEGF у слизовій оболонці товстої кишки є ендотеліальні, епітеліальні клітини та лейкоцити. За допомогою імуноблот-аналізу встановлено зростання вмісту VEGFR-2, який є основним рецептором в опосередкуванні VEGF-стимульованої проникності кровоносних судин та його про-ангіогенних ефектів. Вміст протеїну VEGFR-1 підвищується лише на стадіях хронічного протікання хвороби, що може пояснюватися збільшенням його експресії інфільтрованими моноцитами/макрофагами.

Відомо, що нейтралізація активності VEGF введенням антитіла до VEGF призводить до значного зменшення клінічних та морфологічних параметрів експериментального коліту і за ступенем ефективності не відрізняється від загальновживаного препарату в лікуванні виразкового коліту у людей – 5-аміноса- ліцилової кислоти (месалазін). Важливо відмітити, що введення антитіла до VEGF не призводило до зменшення кількості кровоносних судин в ділянках грануляційної тканини порівняно з тваринами контрольних груп, що вимірювали за кількістю судин, позитивних до маркеру ендотеліальних клітин – фактора фон Віллебранда.

Новоутворені кровоносні судини в патогенезі запальних захво-рювань кишечнику характеризуються підвищеною проникністю та незрілістю, що сприяє інфільтрації лейкоцитів та переходу хвороби у хронічну стадію. Так доведено, що введення нейтралізувального антитіла до VEGF значно зменшує транссудацію фарби Еванса в слизову оболонку товстої кишки при йодоацетамідзумовленому коліті. Таким чином, показано, що зростання рівня VEGF призводить до збільшення проникності кровоносних мікросудин слизової оболонки товстої кишки. Водночас, загоєння виразок на фоні введення нейтралізувального антитіла до VEGF було пов’язано зі зменшенням числа лейкоцитів у ділянці ураження.

Ефекти VEGF на функції ендотеліальних клітин, а саме проліферацію, міграцію, виживання та проникність кровоносних судин, опосередковуються різними внутрішньоклітинними сигнальними шляхами (Erk1/2, Akt, Src) через активацію VEGFR-2.

333

Встановлено провідну роль Src-тирозинкінази в VEGF-опосе- редкованому посиленні проникності кровоносних судин у патогенезі експериментального коліту та досліджено внутрішньоклітинний механізм цього процесу. Розвиток йодоацетамід-зумовленого коліту супроводжується підвищенням вмісту загаль-ного протеїну VEGFR-2 та його фосфорилювання за залишком Tyr951 у слизовій оболонці товстої кишки щурів. Паралельно спостерігається активація Src-тирозинкінази та підвищення міжпротеїнової взаємодії між β-арестином 2 та VE-кадгерином, тоді як загальний вміст протеїну VE-кадгерину залишається без змін.

У літературі вже підтверджено провідну роль посилення проникності кровоносних мікросудин у патогенетичній дії VEGF при запальних захворюваннях кишечнику. І в цьому випадку, продемонстровано активацію Src-кінази, яка відіграє провідну роль в VEGF/VEGFR-2-зумовленому збільшенні проникності кровоносних судин. Фосфорилювання кінази Akt, яка також частково опосередковує дію VEGF на проникність кровоносних судин і, в значній мірі, зумовлює виживання ендотеліальних клітин, також посилюється, але в меншій мірі. При цьому рівень активації Erk1/2, навпаки, є знижений у мишей IL-10-/-.

Ще одним доказом важливої ролі шляху VEGF/VEGFR-2 у збільшенні проникності кровоносних мікросудин у патогенезі запальних захворювань кишечнику є дані літератури щодо активації D2-дофамінових рецепторів. Зокрема показано, що взаємодія дофаміну з D2-дофаміновими рецепторами ендотеліальних клітин супроводжується пригніченням фосфорилювання VEGFR-2 і, як результат, зменшенням проникності крово-носних судин. Згідно з отриманими даними, розвиток експериментального коліту пов’язаний з порушенням синтезу дофаміну, який визначають за рівнем тирозингідроксилази в слизовій оболонці товстої кишки щурів. Агоністи D2-дофамінових рецепторів, квінпірол (1 мг/100 г) та бромокриптин (5 мг/100 г) майже вдвічі зменшують проникність кровоносних судин слизової оболонки товстої кишки щурів з йодоацетамід-зумовленим колітом. Так як, агоністи D2-дофамінових рецепторів широко використовуються в клінічній практиці для пригнічення лактації у жінок (каберголін), а

334

також у пацієнтів з хворобою Паркінсона (бромокриптин) вони можуть стати потенційно новими терапевтичними засобами в терапії запальних захворювань кишечнику.

У науковій літературі описано механізм паралельного підвищення рівня про- і анти-ангіогенних факторів у патогенезі запальних захворювань кишечнику. Так, встановлено роль ендостатину, який є одним з найпотужніших ендогенних антиангіогенних факторів, що має анти-канцерогенні властивості. Він утворюється в результаті протеолітичної деградації колагену XVIII при дії протеїназ, у т. ч. матриксної металопротеїназ-9 (ММР-9).

Показано підвищення вмісту ендостатину в товстій кишці щурів як із йодоацетамід-зумовленим колітом, так і на моделі спонтанних запальних захворювань кишечника в мишей IL-10-/-, яке корелювало зі збільшенням активності та вмісту протеїну MMP-9. Миші з дефіцитом ММР-9 (миші ММР-9-/-) відрізнялися значно нижчим рівнем ендостатину в нормі та на фоні DSS-зумовленого коліту відносно відповідних показників у мишей дикого типу. Водночас рівень іншого анти-ангіогенного фактора – ангіостатину, який також може утворюватись у результаті протеолітичної деградації плазміногену під дією ММР-9, не змінювався. Таким чином встановлено, що ММР-9 відіграє провідну роль в утворенні ендостатину за нормальних умов та при експериментальному коліті.

У літературі продемонстровано паралельне підвищення вмісту ендостатину та двох про-ангіогенних факторів VEGF та PDGF на моделі йодоацетамід-зумовленого коліту та в IL-10-/- мишей. Крім того, знайдено позитивний кореляційний зв’язок між розміром уражень товстої кишки при експериментальному коліті та вмістом ендостатину. Ці дані узгоджуються з результатами щодо збільшення рівня про-ангіогенних факторів ангіогеніну та ангіомо- ентіну-2 у сироватці хворих на запальні захворювання кишечнику і вищого рівня ендостатину в хворих з прогресуючим виразковим колітом.

Одночасне підвищення вмісту VEGF, PDGF та ендостатину припускає існування функціонального взаємозв’язку між цими факторами в патогенезі експериментальних запальних захворювань

335

кишечнику. Порівняльними дослідженнями на мишах ММР-9-/-, що мали знижений рівень ендостатину, та мишах дикого типу з його підвищеним рівнем при DSS-зумовленому коліті показано значне падіння рівня PDGF у мишей ММР-9-/-, яке за своїм характером відповідало змінам у рівні ендостатину.

Результати зазначених вище досліджень дозволили припустити участь ендостатину в регуляції експресії PDGF. Паралельне підвищення PDGF та ендостатину може позитивно впливати на патогенез запальних захворювань кишечнику за рахунок відновлення процесів фізіологічного ангіогенезу. Протилежна картина спостерігалась для VEGF: рівень якого був навіть вищим у мишей ММР-9-/- порівняно з диким типом на фоні коліту, спричиненого DSS. Малоймовірно, що MMP-9 безпосередньо впливає на рівень VEGF, оскільки індукція експресії MMP-9, введенням рекомбінантного аденовірусу, не змінювала цей показник. Ймовірно, підвищення рівня VEGF у мишей ММР-9-/- пов’язане зі зменшенням рівня ендостатину. У літературі показано, що нейтралізація активності VEGF за допомогою антитіла до VEGF призводить до зниження рівня не лише VEGF, але й ендостатину в товстій кишці щурів з експериментальним колітом. Таким чином, встановлено існування регуляторного взаємозв’язку між ендостатином та VEGF.

В оглядових та експериментальних статтях доведено, що, на відміну від про-ангіогенних факторів bFGF, PDGF, HGF, ефекти VEGF протилежні в механізмах виразкоутворення при виразковій хворобі гастродуоденальної зони та запальних захворюваннях кишечнику. Пригнічення активності VEGF значно покращує клінічні та морфологічні показники експериментального коліту, та має протилежну дію при експериментальній виразковій хворобі гастродуоденальної зони. В той час, як введення bFGF, PDGF чи HGF значно посилює загоєння уражень як при експериментальних запальних захворюваннях кишечнику, так і при виразковій хворобі гастродуоденальної зони.

Отже, припускається, що VEGF здатен стимулювати як нормальний/фізіологічний ангіогенез (виразкова хвороба гастродуоденальної зони), так і надмірний/патологічний ангіогенез (запальні

336

захворювання кишечника) в залежності від особливостей патогенезу хвороби, а ендостатин може бути своєрідним антагоністом VEGF-опосередкованих ефектів. Одночасне підви-щення рівня ендостатину та VEGF у слизовій оболонці дванадця-типалої кишки також показано на моделі експеримен-тальної виразки дванадцятипалої кишки. Крім того показано, що введення щурам рекомбінантного ендостатину значно покращує клінічні (втрата маси тіла, консистенція випорожнень, наявність крові в випорожненнях) та морфо-логічні ознаки DSS-зумовленого коліту в мишей. Введення ендостатину щурам з цистеамін-зумовленою виразкою дванадцятипалої кишки, навпаки, справляє негативний ефект на швидкість загоєння виразок.

Таким чином, паралельне підвищення ендостатину в патогенезі запальних захворювань кишечнику (патологічний ангіогенез) є важливою ланкою в системі захисту організму від патологічного впливу надекспресії VEGF. Це положення підтверджується визначеною ефективністю 5-аміносаліциловою кислотою-зумовленого покращення клінічних та морфологічних параметрів експериментального коліту при відновленні балансу між VEGF та ендостатином. Так визначено роль ендотеліального бар’єру в патогенезі запальних захворювань кишечнику.

Сформульовано нову концепцію молекулярних механізмів патогенезу запальних захворювань кишечника з огляду на роль кишечного бар’єру в ньому. Зокрема фактори, що призводять до збільшення проникності кровоносних мікросудин (VEGF) та змінюють функціональну активність ендотеліальних клітин (гіпоксія) можуть сприяти рецидиву хвороби. У літературі припускається, що генетичні чи зовнішні фактори, які призводять до спонтанної зміни щільності міжендотеліальних адгезивних контактів (VE-кадгерин) чи порушення експресії асоційованих з ендотелієм транскрипційних факторів (Egr-1) одночасно є етіологічними факторами схильності до запальних захворювань кишечника. Надмірна активація про-ангіогенного потенціалу в патогенезі запальних захворювань кишечнику супроводжується захисною відповіддю організму у вигляді експресії анти-ангіогенних факторів, одним із яких є ендостатин. Фармакологічна корекція балансу

337

між прота анти-ангіогенними факторами і приведення його до фізіологічної норми може бути використано у лікуванні хворих на запальні захворювання кишечнику. Діагно-стування посилення проникності кровоносних мікросудин у слизовій оболонці кишечнику хворих на ЗЗК рекомендовано як маркер для підбору ефективної терапії, а також як прогностичний маркер при рецидиві хвороби.

Хронічний перебіг запальних захворювань кишечнику, пов’я- заний з порушенням балансу між прота анти-ангіогенними факторами, супроводжується розвитком патологічного ангіогенезу і може бути передумовою розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

У літературі наведено результати комплексного дослідження функціонального стану основних елементів Са2+-залежного сигнального шляху (фосфоліпази С, фосфоліпідів (ФЛ), Са2+, протеїнінази С, Са2+/кальмоду-лінзалежної протеїнкінази) та їх функціональних зв’язків з окремими ланками інших сигнальнх систем (NOсинтази, протеїнкінази А, протеїнкінази G та тирозинової протеїнкінази) в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки за умов експериментального коліт-асоційованого канцерогенезу. Відмічено участь Са2+ та NO-синтази у формуванні первинних проявів запалення при виразковому коліті. Показано накопичення протеїнівмодуляторів мітохондріальної ланки апоптоз, про- (Вах) і антиапоптичного (Bcl-2) протеїнів, на пізніх строках формування онкопатології. Отримані результати є теоретичною основою для науково-обгрунтованої корекції виявлених метаболічних порушень.

Мета і завдання роботи: отримати модель гастроентеропатології з виразково-ерозійним процесом при пероральному введенні лабораторним щурам один раз на добу впродовж двох тижнів розчину препарату диклофенак; відповісти на контрольні питання.

Обладнання, матеріали і реактиви: засоби індивідуального захисту (гумові рукавички, халат та ін. відповідно до вимог техніки безпеки), ваги, шприці, зонди, 5 % розчин натрію диклофенаку.

Хід роботи

1. Проводиться зважування щурів та розрахунок необхідного для введення об’єму препарату;

338

2. Диклофенак вводять щурам (бажано з масою тіла біля 200– 220 г) внутрішньошлунково у дозах 0,80 мг/тварину (тяжка форма перебігу захворювання) або 0,60 мг/тварину (середня тяжкість перебігу захворювання), протягом чотирнадцяти діб, один раз на добу, викликаючи запальний процес в результаті подразнюючої дії хлористоводневої кислоти на незахищену слизову оболонку шлунка та кишечнику.;

3. Через 14 діб після останнього введення препаратів оцінюють стан шлунка та кишечнику.

Контрольні питання

1.Який механізм дії диклофенаку на слизову оболонку шлунка і кишечнику?

2.Як моделюють розвиток гастроентеропатології з виразковоерозійним процесом у лабораторних щурів?

Рекомендована література

1. Пат. № 83904 – Україна. Спосіб моделювання медикаментозного гастроентериту з виразково-ерозійним процесом у лабораторних щурів / Мельничук Д. О., Грищенко В. А., Терещенко С. В., Реброва З. Б. G09В 23/28, – № а 200610876; заявл. 16.10.2006; опубл. 26.08.2008, Бюл. № 16.

2.Томчук В. А. Ліпіди та ентеропатологія телят / В. А. Томчук, В. А. Грищенко. – К.: ЦП «Компринт», 2016. – 508 с.

3.Abd Elazem. Adverse effects of diclofenac potassium and dexamethason on some hematobiochemical and immunological parame-

ters in Egyptian goat bucks / Abd Elazem, M. A. Seham, Y. Abo-Kora.

– Journal of American Science. – 2015. – 11(7). – Р. 92–99.

4.Ahmad I. Hematological effects of diclofenac sodium in goat / I. Ahmad, T. Quresh, U. [et al.] // Journal of Animal and Plant Sciences/

– 23(1)/ – P. 103–107.

5.Basavraj S. B. Haematobiochemical alterations induced by

diclofenac sodium toxicity in Swiss albino mice / S. B. Basavraj, D. T. Fefar, K. S. Prajapati [et al.] // Veterinary World – 2012. – 5(7). – Р. 417–419.

339

6. Early endothelial damage and increased colonic vascular permeability in the development of experimental ulcerative colitis in rats and mice / G. Tolstanova, X. Deng, S.W. French [et al.] // Lab Invest. – 2012; 92(1):9–21 Epub 2011 Sep 5.

7. El-Maddawy Zeynab Kh. Hepato-Renal and Hematological Effects of Diclofenac Sodium in Rats / Kh. El-Maddawy Zeynab, M. ElAshmawy Ibrahim // Global Journal of Pharmacology. – 2013. – 7(2). – Р. 123–132.

8. Gan T. J. Diclofenac: an update on its mechanism of action and safety profile / T. J. Gan. // Current Medical Research and Opinion. – 2010. – 26. – Р. 1751–1731.

9.Gryshchenko V.A. Biochemical properties of the plasma of rats with the experimentally induced hepatitis after oral administration of sodium diclofenac / V.A. Gryshchenko // Regulatory Mechanisms in Biosystems. – 2017. – 8(2). – Р. 191–196.

10.Harirforoosh S. Adverse effects of nonsteroidal antiinflammatory drugs: an update of gastrointestinal, cardiovascular and renal

complications / S. Harirforoosh, W. Asghar, F. Jamali // Journal of pharmacy & pharmaceutical sciences: a publication of the Canadian Society for Pharmaceutical Sciences, Societe canadienne des sciences pharmaceutiques. – 2013. – 16(5). – Р. 821–847.

11. Kernychniy V. Intraoperative diagnosis of ischemic segment of colon that descends to the perineum during abdominal-anal pull-through resection of the rectum. / V. Kernychniy, G. Tolstanova, A. Sukhodolya

//Gut. – 2011. – Vol. 60 (Supl; 5). – P. 9.

12.Orinya O. A. Haematological and biochemical studies on the effect of diclofenac sodium on Wistar Rattus norvegicus / O. A. Orinya,

A. Y. Adenkola, R. J. Ogbe // International Journal of Biological and Chemical Sciences. – 2016. – 10(5), 2231–2242.

13.Ragbetli С. Effects of Diclofenac Sodium on the Rat Liver in Postnatal Period / С. Ragbetli, А. Aydinlioglu, М. Kara [et al.] // Journal of Animal and Veterinary Advances. – 2009. – 8(9). – Р. 1761–1764.

14.Role of D2 Dopamine Receptors in the Pathogenesis of Experimental Ulcerative Colitis: Implication of Colonic Vascular

Permeability / G. Tolstanova, X. Deng, K. Osapay [et al.] // Gastroenterology. – 2010. – Vol. 138. – N 5. – P. S–264.

340