3. Применение клеточных культур для диагностики и лечения наследственных заболеваний.

Ответ. Многие неизлечимые заболевания возникают в силу патологических изменений генома клеток. Традиционные лекарства недостаточно эффективны при их лечении — из-за низкой специфичности и, в ряде случаев, значительного токсического воздействия на организм. Но главное — они не действуют на саму причину подобного рода заболеваний — соматические мутации генома. РНК-интерференция — один из основных методов исследования функций генов в культурах клеток и живых организмах — имеет большой терапевтический потенциал. Посредством посттранскрипционного подавления экспрессии генов (когда двухцепочечная РНК индуцирует деградацию гомологичной мРНК) можно воздействовать на уровне синтеза кодируемых ими белков, модулируя таким образом активность генома клеток на любом этапе развития заболеваний, связанных с нарушениями нуклеотидной последовательности. Характерное преимущество технологии — возможность точной локализации терапевтического действия, например, в очаге опухоли. Использование культивируемых клеток вне организма для диагностики наследственных заболеваний является логическим продолжением метода биопсии, при котором изъятый из организма фрагмент ткани подвергается немедленному (преимущественно морфологическому) исследованию. Однако, благодаря культивированию возможности исследования и диагностики расширяются практически беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но и изменений в поведении клеток, их реакций на различные агенты, в том числе и лекарственный воздействия. Воспроизведение культивируемыми клетками в ряду поколений какого-либо дефекта или изменения, свойственного клеткам in vivo, свидетельствует о наследственной природе этого дефекта или изменения. Именно это обстоятельство делает культивируемые фибробласты ценным объектом физиологической генетики. Благодаря методу культивирования клеток патология человека и антропология становятся экспериментальными науками. При рассмотрении вопроса о возможности и пределах экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo было показано, что 1) фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные этим клеткам в организме; более того, они сохраняют онтогенетические и индивидуально-генотипические свойства организма-донора; 2) не существует другого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма; 3) изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму путем создания соответствующих условий.

4. Применение клеточных культур в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ.

Ответ. In vitro-токсикология – новое направление токсикологических исследований. Вместо лабораторных животных в качестве тест-объектов используют культуры клеток и тканей. In vitro-токсикология интенсивно внедряется в санитарно-гигиеническую экспертизу и доклинические исследования лекарственных средств. Преимущества. Возможность использовать в качестве тест-объектов широкий спектр культур клеток и тканей как млекопитающих, так и человека. Возможность моделировать орано- и тканетоксические эффекты. Возможность использовать одномоментно большое количество доз и токсикантов. В сравнении со стандартными исследованиями на животных – использование культур клеток является менее затратным. Исследования на культурах клеток гуманны и не связаны со страданием лабораторных животных и психологическим дискомфортом у исследователя. Возможность экстраполяции данных, полученных in vitro на тестобъекты in vivo. Тест-объекты: Кератиноциты, Мононуклеарные лейкоциты, Кератиноциты. Мононуклеарные лейкоциты – это эффективная модель для оценки воздействия ксенобиотиков и учѐта их токсических эффектов. Лимфоциты и моноциты обладают широким спектром экспрессируемых генов рецепторов к цитокинам, гормонам и нейромедиаторам. У лабораторных животных дополнительным источником большого количества мононуклеарных лейкоцитов является селезёнка. Культура мононуклеарных лейкоцитов, полученная из селезёнки крысы, является эффективной тест-моделью для оценки токсического эффекта по следующим причинам: однородность клеточного состава; простота подсчёта живых и мёртвых клеток; быстрое наступление токсического эффекта. Культура кератиноцитов являлась эффективной тест-моделью для оценки токсического эффекта по следующим причинам: возможность суммарно исследовать некроз и апоптоз клеток; токсиканты вызывали изменение морфологии клеток - снижался объём цитоплазмы, наблюдалось уменьшение и округление клеток. Токсикологический эксперимент выполнялся следующим образом: к клеткам в лунки планшета добавляли токсикант в необходимой концентрации, инкубировали в термостате требуемое время при температуре 37ºС, добавляли красители для микроскопии. Токсиканты с культурой клеток кератиноцитов инкубировали 24 часа, с культурой клеток селезёнки – 1 час. Проводилась световая и флуоресцентная микроскопия с использованием красителей пропидия йодида и акридинового жёлтого. В основу оценки токсичности было положено свойство красителя пропидия иодида связываться с ДНК, что возможно только в мертвой клетке вследствие нарушения барьерной функции плазмалеммы и кариолеммы. Таким образом, клетки, активно инкорпорирующие пропидий иодид, ярко окрашенные при флуоресцентной микроскопии, считались мертвыми.