17. Биосинтез белка. Этапы трансляции у эукариот. Сравнительный анализ биосинтеза белка у про- и эукариот.

Биосинтез белка:

Биосинтез белка имеет важнейшее научное и клиническое значение. Отличие одного индивидуального белка от другого определяется природой и последовательностью чередования аминокислот, входящих в его состав.

Носителем наследственной информации являются молекулы ДНК (гены), в которых закодированы генетические особенности организма, в том числе состав и структура синтезируемых белков. Первичная структура ДНК представляет собой последовательность мононуклеотидов, каждые три из которых носят название триплет и кодируют определенную аминокислоту. Таким образом, последовательность аминокислот любого синтезируемого белка контролируется последовательностью триплетов ДНК. Этот процесс составляет сущность биосинтеза белка.

Процесс биосинтеза белка состоит из трех этапов.

1. синтез информационной РНК (и-РНК) – транскрипция и перенос её к месту синтеза белка – к рибосомам - синтез и-РНК происходит в ядре, молекула ДНК, состоящая из двух цепочек раскручивается и на одной цепи ДНК строится и-РНК по принципу комплементарности, т.е. каждому азотистому основанию ДНК соответствует азотистое основание РНК. Таким образом, молекула и-РНК в точности повторяет последовательность ДНК, а значит, служит переносчиком наследственной генетической информации, т.е. матрицей.

2. активация аминокислот – присоединение их к транспортной РНК (т-РНК) и перенос их к рибосомам - этап начинается с активации аминокислот при участии ферментов и АТФ с сохранением комплексов аминоациладенилатов. Для каждой аминокислоты есть своя т-РНК, к которой аминокислота и присоединяется. Этот комплекс движется к рибосомам.

Особенность т-РНК заключается в наличии в ней антикодона – триплета строго определенного состава для каждой аминокислоты (пр. фенилаланин – это ААА, метионин УАЦ, аланин – ЦГГ).

3. собственно биосинтез (трансляция) -  в молекуле и-РНК имеются определенные триплеты, которые называются кодонами и которые комплементарны антикодонам и-РНК. По мере передвижения и-РНК по рибосоме происходит их присоединение к комплементарным кодонам и-РНК, а соединенные с т-РНК аминокислоты соответственно взаимодействуют между собой в той последовательности, которая строго зафиксирована порядком соединения кодона и антикодона путем образования полипептидной цепи, специфичной для данного белка (первичная структура, которая в дальнейшем приобретает вторичную и третичную структуру).

Этапы трансляции у эукариот:

Трансляция (как и все матричные процессы) включает три стадии: инициацию (начало), элонгацию (продолжение) и терминацию (окончание).

1. ИНИЦИАЦИЯ. Сущность инициации заключается в образовании пептидной связи между двумя первыми аминокислотами полипептида.Первоначально образуется инициирующий комплекс, в состав которого входят: малая субъединица рибосомы, специфические белки (факторы инициации) и специальная инициаторная метиониновая тРНК с аминокислотой метионином – Мет–тРНКМет. Инициирующий комплекс узнает начало мРНК, присоединяется к ней и скользит до точки инициации (начала) биосинтеза белка: в большинстве случаев это стартовый кодон АУГ. Между стартовым кодоном мРНК и антикодоном метиониновой тРНК происходит кодонзависимое связывание с образованием водородных связей. Затем происходит присоединение большой субъединицы рибосомы.

При объединении субъединиц образуется целостная рибосома, которая несет два активных центра (сайта): А–участок (аминоацильный, который служит для присоединения аминоацил-тРНК) и Р – участок (пептидилтрансферазный, который служит для образования пептидной связи между аминокислотами).

Первоначально Мет–тРНКМет находится на А–участке, но затем перемещается на Р–участок. На освободившийся А–участок поступает аминоацил-тРНК с антикодоном, который комплементарен кодону мРНК, следующему за кодоном АУГ. В нашем примере это Гли–тРНКГли с антикодоном ЦЦГ, который комплементарен кодону ГГЦ. В результате кодонзависимого связывания между кодоном мРНК и антикодоном аминоацил-тРНК образуются водородные связи. Таким образом, на рибосоме рядом оказываются две аминокислоты, между которыми образуется пептидная связь. Ковалентная связь между первой аминокислотой (метионином) и её тРНК разрывается.

2. ЭЛОНГАЦИЯ. Сущность элонгации заключается в присоединении последующих аминокислот, то есть в наращивании полипептидной цепи. Рабочий цикл рибосомы в процессе элонгации состоит из трех шагов: кодонзависимого связывания мРНК и аминоацил-тРНК на А–участке, образования пептидной связи между аминокислотой и растущей полипептидной цепью и транслокации с освобождением А–участка.

На освободившийся А–участок поступает аминоацил-тРНК с антикодоном, соответствующим следующему кодону мРНК (в нашем примере это Тир–тРНКТир с антикодоном АУА, который комплементарен кодону УАУ).

На рибосоме рядом оказываются две аминокислоты, между которыми образуется пептидная связь. Связь между предыдущей аминокислотой и её тРНК (в нашем примере между глицином и тРНКГли) разрывается.

Затем рибосома смещается еще на один триплет, и в результате транслокации тРНК, которая была на Р–участке (в нашем примере тРНКГли), оказывается за пределами рибосомы и отщепляется от мРНК. А–участок освобождается, и рабочий цикл рибосомы начинается сначала.

3. ТЕРМИНАЦИЯ заключается в окончании синтеза полипептидной цепи.

В конце концов, рибосома достигает такого кодона мРНК, которому не соответствует ни одна тРНК (и ни одна аминокислота). Существует три таких нонсенс–кодона: УАА («охра»), УАГ («янтарь»), УГА («опал»). На этих кодонах мРНК рабочий цикл рибосомы прерывается, и наращивание полипептида прекращается. Рибосома под воздействием определенных белков вновь разделяется на субъединицы.

Сравнительный анализ биосинтеза белка у про- и эукариот:

Биосинтез белка у прокариот:

1. Транскрипция: перенос информации с ДНК на иРНК (образование пре-иРНК);

2. Трансляция: перевод иРНК в последовательность белка. Состоит з трех этапов:

• инициация (образование комплекса зрелой иРНК, рибосомы и тРНК)

• элонгация (образование первичной структуры белка)

• терминация (окончание трансляции)

3. Посттрансляция (конформация): сворачивание белка с образованием уровней: вторичного, третичного, четвертичного.

!! Все этапы биосинтеза у прокариот проходят в цитоплазме.

Биосинтез белка у эукариот:

1. Транскрипция: перенос информации с ДНК на иРНК (образование пре-иРНК);

2. Посттранскрипция (процессинг): созревание иРНК. Происходит сплайсинг; на 5’ конце образуется КЭП, который стабилизирует 5’ иРНК и обеспечивает узнавание иРНК и малой субъединицы рибосомы; на 3’ конце образуется поли-А последовательность, которая стабилизирует 3’ иРНК и транспортирует иРНК к рибосоме (образование зрелой и-РНК);

3. Трансляция: перевод иРНК в последовательность белка. Состоит з трех этапов:

• инициация (образование комплекса зрелой иРНК, рибосомы и тРНК)

• элонгация (образование первичной структуры белка)

• терминация (окончание трансляции)

4. Посттрансляция (конформация): сворачивание белка с образованием уровней: вторичного, третичного, четвертичного.

!! Транскрипция и процессинг у эукариот проходят в ядре, а трансляция и конформация – в цитоплазме.

18. Генетическая инженерия. Задачи, методы, перспективы. Пути искусственного синтеза гена. Получение рекомбинативных молекул. Теоретические предпосылки генной инженерии. Преимущества генной инженерии по сравнению с селекцией. Значение генной инженерии для фундаментальной и прикладной науки.

Генетическая инженерия:

Генная инженерия – это отрасль молекулярной биологии и генетики, целью которой является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, не встречающимися в природе, комбинациями генов. В основе генной инженерии лежит возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. Эти эксперименты стали возможными благодаря установлению универсальности генетического кода и успехам генетической энзимологии, которая предоставила набор ферментов, позволяющих получать в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот и объединять их информацию.

Задачи, методы, перспективы:

Цель генной инженерии – конструирование генетических структур по намеченному плану (создание организмов с новой генетической программой путем переноса генетической информации из одного организма в другой).

ЗАДАЧИ:

1.Создание рекомбинантных ДНК, пригодных для переноса в другие клетки

2. Разработка методов введения рекомбинантной ДНК в клетку

3. Создание условий для нормальной экспрессии генов, введенных в клетку

МЕТОДЫ: генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации.

1. Получение генетического материала

2. В ДНК, способную реплицироваться автономно (вектор) ферментативно встраивают фрагменты ДНК из любого источника

3. Получаемые при этом молекулы гибридной ДНК вводят в E.coli

4. в E.coli рекомбинантные молекулы ДНК реплицируются, размножая в своем составе клонируемый фрагмент ДНК

5. Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип

ПЕРСПЕКТИВЫ:

Получение ДНК зондов для исследования структуры и функций и экспрессии генов

Дальнейшее развитие «обратной генетики»: зная белок, выделяют и мядифицируют, кодирующий его ген, и получают белок с новыми свойствами

Развитие и совершенствование генной терапии: методологии лечения наследственных болезней

Получение ГМО, трансгенных растений и животных с полезными для человека свойствами

Пути искусственного синтеза гена:

Известны 2 пути искусственного синтеза генов:

• химический

• ферментативный

Для химического синтеза необходимо иметь полностью расшифрованную последовательность нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов в ДНК определяют по и-РНК.

Впервые в 1970г. в США индийский ученый Корана осуществил искусственный синтез гена. Но этот ген не работал in vitro (в пробирке). Причиной являлся синтез только структурной части гена (в нем не было регуляторной части).

В 1976г. был синтезирован ген, состоящий не только из структурного участка, но и регуляторных частей. Этот искусственный ген был введен в бактерию и функционировал в ней как природный. Химическим путем можно синтезировать небольшие по размеру гены прокариот. Синтез генов эукариот, состоящих из 1000 и более нуклеотидов путем химического синтеза создавать не удается. Кроме этого это метод очень трудоемкий и практически не применяется на практике.

Наиболее успешным оказался ферментативный синтез. Это метод поколебал центральную догму молекулярной генетики, утверждающую, что считка информации происходит в направлении ДНК > и-РНК > белок.

Оказалось, что РНК может быть предшественником ДНК. Подобное наблюдается у онкогенных РНК содержащих вирусов. С РНК вируса, попавшего в клетку, синтезируется ДНК-копия РНК с помощью фермента - обратная транскриптаза. Сам процесс называется обратная транскрипция.

Но гены, синтезированные с помощью ревертаз (обратная транскриптаза) не имеют регуляторной части, а это препятствует функционированию искусственных генов в животных клетках, что ограничивает их использование. Кроме того, и-РНК в клетках очень немного, и она не стойкая.

В настоящее время рекомбинантные молекулы ДНК чаще всего получают путем гибридизации инвитро фрагментов ДНК вирусного и бактериального происхождения, и в меньшей степени эукариотического происхождения.

Получение рекомбинативных молекул:

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК. Для этого применяют рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются «липкие» концы — неспаренные участки цепей, способные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают «липкие» концы, используя ту же рест-риктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются «липкие» концы, комплементарные «липким» концам рестриктированной плазмиды. Если теперь смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирную связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комбинацию последовательностей (или генов), такую, какой прежде в природе не было.

Теоретические предпосылки генной инженерии:

1. К началу развития науки генной инженерии был установлен механизм информационного взаимодействия между основными макромолекулами, участвующими в передаче наследственной информации от одного организма другому. Это – репликация, матричный синтез ДНК, при котором цепочка ДНК расплетается, и на каждой образуются новые, комплиментарные. По такому же механизму на ДНК синтезируются комплиментарные ей РНК – транскрипция. На матрице РНК на рибосомах осуществляется синтез белка, структура которого соответствует структуре мРНК – трансляция.

2. Следующий шаг на пути к генной инженерии – открытие внехромосомной самореплицирующейся ДНК или мини-хромосом, которые получили название плазмиды.

3. Выделение и получение ферментов рестриктаз, которые специфически расщепляют ДНК, позволило манипулировать с фрагментами ДНК и привело к возможности изолировать индивидуальный ген. Приемы генной инженерии позволяют проводить рекомбинацию

Преимущества генной инженерии по сравнению с селекцией:

• Значительное ускорение создания сорта (1- 3 года против 10 и более лет).

• Избавление от значительного количества «генетического балласта».

• Создание растений с заданными признаками. Традиционная селекция отбирает растения, которые нас устраивают, биотехнология создает растения, которые нам нужны.

• Большая возможность контроля целевого гена за счет управления его экспрессией в нужных органах, тканях и в нужное время.

Значение генной инженерии для фундаментальной и прикладной науки:

• Производство лекарственных препаратов

• Производство генно-инженерных вакцин

• Генная терапия наследственных заболеваний

• Трансгенные растения, животные