Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Технология микроного синтеза бт.pdf
Скачиваний:
73
Добавлен:
01.07.2022
Размер:
1.96 Mб
Скачать

Учреждение образования «БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Н. С. Ручай, И. А. Гребенчикова

ТЕХНОЛОГИЯ МИКРОБНОГО СИНТЕЗА

Электронный курс лекций для студентов специальности 1-48 02 01 «Биотехнология»

Минск 2014

УДК 602.4(0.034) ББК 28.072я73

Р92

Рассмотрен и рекомендован к изданию редакционноиздательским советом Белорусского государственного технологического университета

Р е ц е н з е н т ы : кандидат биологических наук,

заведующий отделом промышленных биотехнологий государственного предприятия «НПЦ ЛОТИОС»

К. М. Белявский;

кандидат технических наук, ведущий научный сотрудник отдела лекарственных веществ

ГНУ «Институт физико-органической химии НАН Беларуси»

Н. Н. Якимович

Ручай, Н. С.

Р92 Технология микробного синтеза : электронный курс лекций для студентов специальности 1-48 02 01 «Биотехнология» / Н. С. Ручай, И. А. Гребенчикова. – Минск : БГТУ, 2014. – 167 с.

Приведена характеристика биологических агентов, применяемых в биотехнологии, сырья и основных компонентов питательных сред; рассмотрены процессы приготовления и стерилизации питательных сред и получения стерильного воздуха, промышленные способы культивирования микроорганизмов, основы асептики в ферментационных процессах, методы выделения продуктов микробиологического синтеза. Представлены технологии современного промышленного производства продуктов микробного синтеза: белка одноклеточных, ферментных препаратов, антибиотиков, микробиологических средств защиты растений, бактериальных удобрений, витаминов, лимонной кислоты, микробного жира, а также информация о перспективах промышленного производства полисахаридов и нуклеозидов. Рассмотрены вопросы безопасности в биотехнологических производствах.

УДК 602.4(0.034) ББК 28.072я73

УО «Белорусский государственный технологический университет», 2014

Ручай Н. С., Гребенчикова И. А., 2014

2

ВВЕДЕНИЕ

Микробиологический синтез составляет основу биотехнологических производств, разнообразие которых определяется свойствами используемых микроорганизмов, являющихся продуцентами биологически активных веществ. Знание основ технологии микробиологического синтеза является одним из важнейших критериев, определяющих уровень профессиональной подготовки биотехнологов.

Задачей дисциплины является изучение теории и практики промышленного производства важнейших продуктов микробного синтеза, что необходимо для обеспечения эффективной производственной деятельности инженеров-биотехнологов.

Материал курса лекций условно разделен на две неразрывно связанные между собой части, в одной из которых изложены теоретические основы, особенности аппаратурного оформления и методы реализации технологических процессов, составляющих современное промышленное биотехнологическое производство, а в другой представлены технологические линии производства конкретных продуктов микробиологического синтеза с использованием различных видов сырья и продуцентов биологически активных веществ.

В первой части лекционного курса рассмотрены биологические агенты, сырье и компоненты питательных сред, приготовление и стерилизация питательных сред, получение стерильного воздуха, промышленные способы культивирования микроорганизмов, методы получения посевного материала, мероприятия, обеспечивающие асептические условия ферментации, способы выделения и сушки продуктов микробного синтеза.

Вторая часть лекций базируется на предыдущем материале и посвящена современным технологиям производства препаратов кормового белка, антибиотиков, ферментных препаратов, средств защиты растений, бактериальных удобрений, кормовых препаратов, витаминов, лимонной кислоты, технического микробного жира.

Завершают курс лекций раздел, посвященный перспективным процессам биосинтеза полисахаридов и нуклеозидов, и раздел по технике безопасности в микробиологических производствах.

3

1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ

Важнейшими компонентами биотехнологических процессов, определяющими получение целевого продукта, являются биологические агенты. Номенклатура используемых в биотехнологической практике биологических агентов разнообразна и неуклонно расширяется. Современные биотехнологические производства базируются на использовании следующих групп биологических агентов:

клеток микроорганизмов;

растительные и животные тканевых клеток, клеток тканей человека;

компонентов клеток (протопластов, мембран, митохондрий, хлоропластов и др.);

рекомбинантов, полученных методами генетической инженерии;

внеклеточных продуктов (ферментов, коферментов);

вирусов.

В производственной практике наиболее широко используется традиционный биологический агент – микробная клетка. Выявляются все новые виды микроорганизмов, которые могут быть использованы в биотехнологии как продуценты полезных веществ. В связи с этим важное значение приобретают специализированные банки биологических агентов, коллекции генетически охарактеризованных микроорганизмов, криобанки клеток тканей животных и растений. Наиболее крупные коллекции промышленных микроорганизмов созданы

вСША: Coli-центр, Bacillus-центр, грибной центр и др. Основная задача коллекции – сохранение жизнеспособности и генетических свойств штаммов. Коллекции культур играют также важную роль

впроцедуре правовой защиты новых патентуемых штаммов.

Сростом номенклатуры биопродуктов сформировались современные тенденции в использовании микробных клеток, которые связаны с применением термофильных микроорганизмов, анаэробных культур, смешанных культур микроорганизмов и их ассоциаций, иммобилизованных клеток микроорганизмов.

Термофильные микроорганизмы отличаются высокой конкурентоспособностью, при их культивировании предъявляются менее жесткие требования к уровню стерильности и снижаются затраты на охлаждение ферментационной среды, возможна самопроизвольная дистилляция целевого метаболита (например, при спиртовом брожении).

Возрождается интерес к использованию анаэробных микроорганизмов, которые часто также являются термофилами. Анаэробные

4

процессы привлекают внимание исследователей малыми энергетическими затратами на процесс (нет необходимости в аэрации и интенсивном перемешивании питательной среды), а также возможностью получения в качестве побочного продукта энергоносителя – биогаза или водорода. В связи с этим анаэробные процессы можно относить не только к энергосберегающим, но и к энергопродуцирующим.

Расширяется применение смешанных культур микроорганизмов и их ассоциаций. В природе микроорганизмы существуют в виде сообществ различных популяций, тесно связанных между собой. Ассоциации культур в сравнении с монокультурами имеют ряд преимуществ:

способность ассимилировать сложные субстраты, малодоступные для монокультур;

более высокая продуктивность;

повышенная устойчивость к токсичным веществам и изменяющимся факторам окружающей среды.

Основная область применения смешанных культур – биодеградация сложных по составу или обладающих токсичностью субстратов.

Вчастности, ассоциации микроорганизмов перспективны в процессах биоконверсии целлюлозосодержащих субстратов.

Практически все биологические агенты могут быть использованы в биотехнологических процессах в иммобилизованной форме. В природных условиях закрепление микробных клеток на различного вида носителях является естественным и распространенным процессом.

В биотехнологических производствах применяют следующие виды иммобилизации микробных клеток и ферментов:

включение в гели, капсулы;

адсорбция на поверхности твердых носителей;

ковалентное связывание с носителем;

сшивка бифункциональными реагентами без использования носителя;

«самоагрегация» интактных клеток при создании определенных условий с образованием хлопьев и гранул.

Создание и использование биосистем с иммобилизованными биологическими агентами – одно из современных направлений развития биотехнологической отрасли, что обусловлено существенными преимуществами иммобилизованных клеток и ферментов перед свободными:

удержание биоагентов в объеме реактора;

возможность создания высокой регулируемой концентрации биоагента в реакторе;

возможность организации непрерывного процесса с многократным использованием агента и высокой скоростью протока среды;

5

удешевление процесса выделения целевого продукта из культуральной среды, не содержащей клеточной массы;

более высокая активность (продуктивность) и стабильность биоагента в иммобилизованном состоянии;

повышение устойчивости иммобилизованных биоагентов к неблагоприятным факторам среды;

возможность промышленного использования дорогостоящих биоагентов (например, ферментов);

использование иммобилизованных биоагентов в создании биологических микроустройств (ферментных электродов, биологических датчиков, запоминающих устройств и т. д.).

Набор биологических агентов непрерывно пополняется новыми, нетрадиционными объектами, появляются нестандартные биотехнологические процессы.

Особое внимание в настоящее время уделяется созданию не существующих в природе биологических агентов методами генетической инженерии. Сформировалось направление конструирования искусственных клеток.

Разрабатываются подходы к созданию искусственных ферментов

и аналогов ферментов, обладающих повышенной стабильностью

иактивностью.

Кнетрадиционным биологическим агентам на данном этапе развития биотехнологии относятся растительные и животные тканевые клетки, а также клетки тканей человека.

Биотехнология клеток растений – это молодая отрасль. Культуры растительных клеток могут быть использованы:

– в биосинтетических и биотрансформирующих реакциях;

– для изучения метаболизма растений, а также системы «растение – паразит» (вирусы, грибы, насекомые и т. д.);

– при микроразмножении и получении новых форм растений в агротехнике.

Растительные клетки можно культивировать как на твердой среде, так и глубинным способом. При крупномасштабном культивировании суспензии клеток растений следует учитывать, что эти клетки чрезвычайно чувствительны к эффекту среза и быстро лизируются при интенсивном механическом перемешивании среды (большинство клеток погибает уже к 20–30-му часу культивирования). Клетки растений имеют также тенденцию агрегироваться, что затрудняет контроль параметров процесса и нарушает массообмен.

Получение культуры клеток растений начинают с отбора в асептических условиях кусочка ткани растения. Используют различные ткани

6

любого органа растения (чаще ствол или листья). Ткань помещают в среду, содержащую питательные вещества и факторы роста. Рост происходит в виде каллуса, который в дальнейшем культивируют на твердой среде или используют для получения суспензии клеток. Каллус представляет собой дезорганизованную массу недифференцированных клеток, способных к росту и образованию метаболитов. Ткань каллуса гетерогенна по морфологии и биохимическим свойствам. Для получения суспензионной культуры небольшое количество каллусной ткани помещают в жидкую среду и культивируют на качалке в течение 2–3-х недель. Суспензионная культура более гомогенна и растет быстрее. Часть клеток образует агрегаты различных размеров. Предпочитают в дальнейшем использовать суспензию из отдельных клеток. Время генерации клеток растений составляет в среднем 30–70 ч.

Культуры клеток растений могут быть использованы для биосинтеза вторичных метаболитов (аминокислот, витаминов, гормонов, красителей, липидов, нуклеиновых кислот, полисахаридоы, стероидов, ферментов, терпенов, регуляторов роста и т. д.), а также для биотрансформации химических соединений. Однако экономически выгодных биотрансформационных процессов мало. Культивирование клеток осуществляют в условиях асептики. Для получения метаболитов можно использовать иммобилизованные клетки растений. Важнейшим их преимуществом является повышенная устойчивость к механическим повреждениям.

Внастоящее время основными недостатками использования культур тканей растения для получения метаболитов являются:

– высокий уровень инфицирования ферментационной среды;

– низкая скорость роста (время генерации клеток примерно в 100 раз больше, чем у микроорганизмов);

– низкий выход продуктов при большой продолжительности процесса.

Внастоящее время культуры клеток растений рассматриваются как биологические агенты для получения дорогостоящих, требующихся в небольшом количестве соединений.

Особый интерес представляет способность культур растений к тотипотенции, т. е. регенерации целого растения из отдельной клетки (в любой клетке растения заложена информация, необходимая для дифференцирования клеток при делении). Это явление используется в агротехнике. Микроразмножение растений имеет следующие преимущества:

– возможность получения растений, не содержащих возбудителей болезней;

7

возможность быстрого размножения (в течение круглого года) медленно растущих растений или новых видов растений;

однородность рассадочного материала;

– возможность длительного хранения генетического материала

иобмена им;

возможность создания новых генотипов растений.

Новые формы растений создают с использованием приемов клеточной инженерии: гибриды получают с помощью парасексуальной гибридизации путем слияния протопластов. Этот метод отличается тем, что в качестве родительских используются не половые клетки (гаметы), а соматические клетки растения. В большинстве случаев применяют протопласты листа либо протопласты из каллусных тканей. Из гибридных клеток, полученных таким путем, регенерируют целые растения – гибриды.

Традиционный селекционный процесс (основанный на применении полового скрещивания как средства генетического обмена) отличается длительностью (несколько лет), и скрещивание возможно между филогенетически близкими растениями.

Путем слияния протопластов успешно осуществляют гибридизацию при межвидовых, межродовых и даже межсемейственных скрещиваниях. В настоящее время при селекционных центрах создаются лаборатории клеточной инженерии, в которых отрабатывается техника парасексуальной гибридизации.

В промышленных условиях культура клеток растений в виде каллусной ткани применялась при производстве спиртового экстракта биоженьшеня.

Культуры клеток тканей животных и человека используются

вследующих основных направлениях:

производстве вирусных вакцин, изучении действия вирусов

ивлияния различных факторов на вирусную инфекцию;

получении физиологически активных веществ, например интерферонов;

трансплантации тканей человека (пересадка клеток поджелудочной железы для больных сахарным диабетом);

производстве моноклональных антител;

получении препаратов стволовых клеток для терапевтических целей.

Крупномасштабное культивирование клеток животных и человека осложнено тем, что клетки вне организма растут плохо. Для культивирования клеток используются естественные среды (сыворотка,

8

сгустки плазмы, тканевые экстракты). Созданные синтетические среды (среда Маккоя, среда Игла и др.) имеют сложный состав (более 50 компонентов). Большинство клеток растут на поверхности субстрата в виде монослоя (поверхностно-зависимые клетки). Суспензионный метод культивирования свободных клеток в реакторе требует специальной аппаратуры: конструкция должна обеспечивать интенсивное перемешивание среды без разрушения клеток. В связи с этим разрабатываются суспензионные методы выращивания клеток на носителях. Проблема создания крупномасштабных систем для культивирования клеток животных и человека не решена.

Основой современной промышленной биотехнологии является микробиологический синтез, в котором используются различные группы микроорганизмов для получения широкого ассортимента продуктов (рисунок).

Аминокислоты

 

 

 

 

Органические растворители:

 

 

 

Белок

 

 

 

 

ацетон, бутанол, этанол

 

 

 

 

 

Ферменты

 

 

 

 

Энтомопатогенные препараты

Бактерии

Полисахариды

 

 

 

Биоудобрения

 

 

 

 

 

Витамины

 

 

 

 

Антибиотики

Нуклеозиды

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Актиномицеты

 

Антибиотики

Белок Ферменты

Белок Микробный жир Витамины: D2, B2

Грибы

 

Органические кислоты

 

 

Энтомопатогенные препараты

 

 

 

Антибиотики

 

 

 

 

Органические растворители:

 

 

Дрожжи

 

этанол

 

Водоросли

 

Аминокислоты: триптофан

 

 

 

Белок

 

Вирусы

 

Энтомопатогенные препараты

 

 

 

Промышленные продукты микробиологического синтеза

9

Важнейшими преимуществами микробиологического синтеза являются использование дешевого сырья, часто в виде промышленных отходов, возможность синтеза сложных органических соединений в одну стадию в мягких условиях (низкая температура, невысокое давление).

Эффективность микробиологического синтеза определяется прежде всего возможностями микроорганизмов – продуцентов целевых продуктов. К промышленным продуцентам предъявляются определенные требования, в числе которых:

высокая скорость роста;

непатогенность штаммов, нетоксичность биомассы;

термотолерантность;

высокий выход биомассы (или метаболита) от субстрата;

фагоустойчивость;

легкость выделения клеток из культуральной жидкости;

конкурентоспособность, устойчивость в процессе непрерывного культивирования;

возможность культивирования в нестерильных условиях;

минимальное накопление второстепенных продуктов метаболизма в культуральной жидкости.

10

2.СЫРЬЕ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

ВМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВАХ

Важнейшим фактором, влияющим на рост микроорганизмов и биосинтез ими различных биологически активных веществ, является состав питательной среды, а также условия ее приготовления и стерилизации. Производственная питательная среда должна быть полноценной, т. е. содержать обоснованный и сбалансированный набор компонентов, необходимых для построения клеточной массы и синтеза целевого продукта. В питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых формируется клетка. Состав среды для каждого вида используемого в производстве микроорганизма индивидуален. Универсальной среды не существует.

В технологии микробного синтеза используют разнообразные среды (рис. 2.1).

Питательные среды

по происхождению

натуральные

полусинтетические

 

 

 

синтетические

по консистенции

жидкие

плотные (агаризованные)

 

 

сыпучие

Рис. 2.1. Классификация производственных питательных сред

Натуральные среды – это комплексные среды неизвестного или неопределенного состава, полученные на основе природных веществ растительного или животного происхождения (молоко, пшеничные отруби, кукурузный экстракт, зерновое сусло, молочная сыворотка и др.). Комплексные натуральные среды используют, в частности, в производстве этанола, ферментных препаратов. Особенность натуральных сред состоит в том, что они сложны и непостоянны по составу, это часто делает их малопригодными для крупнотоннажного производства.

Синтетические среды включают комплекс органических и неор-

ганических химических соединений известной природы,

взятых

в определенных количествах. Преимущество синтетических

сред –

11

постоянство состава и воспроизводимость, отсутствие балластных веществ, затрудняющих получение высокоочищенного целевого продукта. Однако для обеспечения полноценности таких сред необходимо, как правило, вносить микродобавки – факторы роста.

Полусинтетические среды, кроме органических и неорганических веществ известного состава, содержат в определенном количестве компоненты природного происхождения (мелассу, пшеничную муку, кукурузный экстракт и др.). К полусинтетическим средам относят кондиционированные гидролизаты растительных материалов.

Рассмотренное разделение питательных сред условно. Многие специалисты-биотехнологи считают целесообразным строгое разделение сред на синтетические и натуральные, в состав которых входят какие-либо природные продукты или отходы производств.

Основными компонентами питательных сред являются источники углерода, азота, фосфора, микроэлементов, факторов роста. В наибольшем количестве в средах присутствует углеродсодержащий компонент. В производственной практике в качестве источника углерода чаще всего используют углеводы (прежде всего сахарозу, крахмал), а также органические кислоты (уксусная кислота), спирты (этанол, метанол), н-парафины (фракция С11–С18). В асептических производствах (аминокислот, антибиотиков) распространенным компонентом питательных сред является отход свеклосахарного производства – меласса, которая представляет собой сиропообразную жидкость темнокоричневого цвета, содержащую 70–85% сухих веществ (плотность – 1300 кг/м3), в том числе 45–50% сахарозы, 50–120 мг/т витамина В7. В мелассе содержатся аминокислоты, органические кислоты, макро- и микроэлементы. Ресурс мелассы в Республике Беларусь составляет около 1 млн. т в год.

Состав мелассы непостоянен. Качество ее зависит от ряда факторов: климатических условий вегетации свеклы, времени уборки и условий хранения корнеплодов, технологии производства сахара, условий хранения мелассы и др. При длительном хранении мелассы ее качество ухудшается: развиваются микроорганизмы, расщепляются углеводные и белковые компоненты, протекают сахароаминные реакции, повышается температура в хранилище (до 70–90°С), возрастает кислотность, в объеме мелассы скапливаются выделяющиеся газы (СО2, Н2, NН3 и др.), возникает угроза газового выхлопа. Необходимо соблюдать определенные правила при хранении мелассы:

хранилища перед заполнением тщательно дезинфицируются;

при сливе мелассы из цистерны допускается минимально необходимый разогрев с последующим охлаждением массы в хранилище;

12

осуществляется контроль за температурой мелассы в хранилище;

предусматривается механическая или пневматическая гомогенизация мелассы при хранении;

не допускается длительное хранение инфицированной и кислой мелассы с содержанием сухих веществ менее 74%.

При культивировании ауксотрофных мутантных штаммов, дефицитных по аминокислотам, необходимым компонентом питательной

среды является кукурузный экстракт – сиропообразная жидкость коричневого цвета (плотность – 1200 кг/м3). Получают в крахмалопаточном производстве в результате гидротермической обработки кукурузного зерна при 50°С в течение 40–50 ч. Полученные замочные воды упаривают до содержания сухих веществ 40–50%. Кукурузный экстракт стабилен при хранении, широко применяется в микробиологическом синтезе. Он является источником азотистых веществ (40– 50% от СВ), причем более половины из них представлены аминокислотами. Содержит также белки, витамины (биотин), углеводы, макро-

имикроэлементы. Основный недостаток – нестабильность состава. Аналогом кукурузного экстракта может выступать дрожжевой

экстракт, а также гидролизат кормовых или пищевых дрожжей.

В составе питательных сред в качестве источника углеводов часто используется кукурузная мука, содержащая 65–75% крахмала, до 10% других углеводов (клетчатка, пентозаны), 10–12% белка, до 4% жира, 0,8–1% минеральных веществ. Соевая мука входит в состав питательных сред как источник азотистых веществ – белков (до 30% от СВ).

Пшеничные отруби – отход мукомольного производства – являются полноценным сырьем и могут входить в состав питательной среды единственным компонентом. Широко используются в питательных средах для производства ферментных препаратов, а также как наполнитель в различных биопрепаратах кормового назначения. Основными компонентами пшеничных отрубей являются крахмал (16–20%),

клетчатка (12–15%), белок (10–12%).

Наряду с рассмотренными компонентами в состав питательных сред входят минеральные соли, содержащие азот, фосфор, калий, магний и другие элементы. Из минеральных азотсодержащих веществ наиболее часто применяют водный аммиак, мочевину и аммонийные соли серной, соляной или азотной кислот. Для биосинтеза многих соединений оказался наиболее пригодным (NH4)2SO4. В результате использования азота микроорганизмами в ферментационной среде накапливаются неассимилируемые анионы кислот, возрастает кислотность среды (по этой причине такие соли называют «физиологически кислыми»). Во избежание закисления в состав исходной среды добав-

13

ляют мел в количестве около 1% или корректируют рН среды щелочью в процессе ферментации.

Источником фосфора в питательных средах являются диаммонийфосфат (полностью ассимилируемая соль), а также одно- и двухзамещенные фосфорнокислые соли калия.

Микроэлементы вводят в питательную среду в виде соответствующих солей – сульфатов, реже в виде хлоридов (хлор-ион обладает более высоким коррозионным действием на материал оборудования).

В аэробных ферментационных процессах культуральная жидкость вспенивается в результате интенсивной аэрации. В связи с этим в составе среды предусматривается присутствие пеногасящего вещества (растительные масла, животный жир, синтетические полиэфиры (пропинол Б-400) и др.). Однако в процессе стерилизации питательной среды пеногаситель, обволакивая микробные клетки, повышает их устойчивость к температуре. По современным требованиям пеногаситель дозируют непосредственно в ферментатор по сигналу датчика уровня пены в аппарате.

Потребность микроорганизмов в тех или иных соединениях определяется их физиологическими особенностями. В самом первом приближении потребность микроорганизмов в питательных веществах можно определить по химическому составу биомассы микробной клетки, однако в этом случае не учитывается количество и состав метаболитов, удаленных клеткой во внешнюю среду, а также то обстоятельство, что химический состав клетки зависит от состава среды обитания и варьируется в значительных пределах.

Формирование состава питательных сред осуществляют по следующей схеме (рис. 2.2).

Удовлетворение

 

Выбор сырьевых

 

Оптимизация

питательных

 

 

 

источников

 

состава

потребностей

 

 

 

и компонентов

 

питательных сред

микроорганизмов

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 2.2. Формирование состава питательных сред

В производстве продуктов микробного синтеза в качестве питательных сред используют жидкие отходы промышленных производств, например, молочную сыворотку, послеспиртовую барду, сульфитный щелок (отход производства целлюлозы сульфитным методом). Перспективно использование гидролизатов растительных материалов, являющихся возобновляемым сырьем.

14