Антитела, их структура и функции

Антителами (иммуноглобулинами) называют растворимые белки

(гликопротеины), присутствующие в сыворотке крови и др. биологических жидкостях, синтезирующиеся в ответ на контакт антигенов с клетками иммунной системы и предназначенные для специфического связывания антигенов. Для синтеза нормальных антител не требуется взаимодействия ИКК с антигеном.

В организме молекулы антител, помимо растворимой, могут находиться и в других формах: в составе иммунных комплексов (антиген-

антитело); в структуре BCR; фиксированными на мембранах клеток,

имеющих Fc-рецепторы (макрофагах, нейтрофилах и др.).

Существует 5 классов иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA

(сывороточный и секреторный), IgD, IgE. Полипептидные цепи Ig существуют не в виде линейных последовательностей аминокислот, а имея вторичную и третичную структуру, закручены в виде глобул, называемых доменами.

Принципиально структура любого мономера Ig (рис.15)

представлена двумя парами полипептидных цепей — L (легких, от англ. light)

и H (тяжелых, от англ. heave), связанных дисульфидными связями и распадающимися при обработке папаином на 3 фрагмента:

Рис.15. Строение молекулы иммуноглобулина

два вариабельных (Fab), предназначенных для связывания с эпитопами антигена; каждый фрагмент представлен одним вариабельным и одним константным доменом и имеет активный центр (паратоп);

один константный (Fc) - представлен двумя (для IgG, IgA, IgD) или тремя (для IgM иIgE) константными доменами, ответственен за

взаимодействие с компонентами комплемента и прикрепление к соответствующим рецепторам на мембранах клеток.

Антитела, имеющие только один активный центр, называются неполными.

В пределах молекулы антитела возможно наличие идиотипа как индивидуального (частного), являющимися уникальным по специфичности к конкретному эпитопу, так и общего (перекрестнореагирующего),

характерного для антител к различным распространенным антигенам.

Идентичные антитела (одинаковой специфичности и изотипа),

являющиеся продуктами одной плазматической клетки-предшественницы,

полученные в лабораторных условиях методом «гибридом» и выделяемые из крови животных, называются моноклональными.

Таблица 10

Характеристика классов иммуноглобулинов

Взаимодействие антител с антигенами обратимо, причем прочность взаимодействия напрямую зависит от степени комплементарности активного центра антитела и антигенной детерминанты, т. е. от уровня специфичности АТ, что выражается термином «афинность».

«Авидность», или жадность, — термин, показывающий, какое количество антигенов одновременно способна связать молекула антитела.

Наиболее авидными (за счет наличия 10 активных центров в пентаме-ре), но при этом малоафинными являются IgM; в то время, как IgG,

обладая более низкой авидностью, являются высокоафинными и тем самым наиболее эффективно блокирующими антигены. Появление на первом этапе инфекционного процесса (при первичном иммунном ответе) именно IgM

обусловлено их способностью связывать большое количество антигенов, что позволяет в начале эффективно сдерживать развитие заболевания.

Защитная (эффекторная) роль антител

1.Прямое действие:

1)нейтрализация токсинов бактерий и других высокомолекулярных веществ биологического происхождения;

2)поверхностная блокада мембранных структур патогенов с угнетением их подвижности и адгезии на клетках-мишенях, способности

преодолевать тканевые барьеры.

2.Косвенное действие, опосредованное привлечением эффекторных механизмов врожденного иммунитета:

1)активация системы комплемента по классическому пути;

2)опсонизация антигена с облегчением его фагоцитоза;

3)антителозависимое усиление цитотоксичности нормальных киллеров.

Главное преимущество адаптивного иммунитета перед врожденным — формирование иммунологической памяти, резко повышающей эффективность иммунной защиты при повторной встрече с антигеном.

По мере успешной реализации иммунной защиты, приводящей к элиминации патогенов, происходит активация деятельности регуляторных Т-

лимфоцитов. Они ограничивают все виды активности лимфоцитов и предотвращает чрезмерное развитие иммунных реакций, способное привести к повреждению тканей и формированию иммунопатологических процессов

(аллергических реакций, аутоиммунных заболеваний).

Конкретные пути и формы реализации иммунного ответа зависят,

прежде всего, от локализации патогена. Так, внеклеточные патогены, а также их растворимые продукты (токсины), доступны для действия продуктов антителозависимого иммунного ответа - специфических антител. Бактерии с внутриклеточной локализацией, устойчивые к внутриклеточному киллингу

(при незавершенном фагоцитозе), недоступны для действия антител, но могут быть разрушены при «форсированном» фагоцитозе, и, следовательно, адекватной формой иммунного ответа будет

служить воспалительный вариант Т-лимфоцитзависимого ответа.

Применение иммунологических методов в практике

Существует несколько основных направлений, при которых

используются иммунологические методы:

иммунодиагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний

(аллергических, аутоиммунных, опухолевых), а также оценка неиммунных показателей (концентрации гормонов, лекарственных и наркотических препаратов в биологических жидкостях и др.);

оценка состояния иммунной системы (иммунного статуса), которую условно можно отнести и в группу иммунодиагностических исследований;

оценка напряженности противоинфекционного иммунитета;

иммунопрофилактика (активная - путем вакцинации, пассивная - при профилактическом введении иммунных сывороток и иммуноглобулиновых препаратов);

иммунотерапия.

Серологические реакции и их применение

Серологическими (serum – сыворотка, logos - учение)

реакцияминазывают реакции между комплементарными антигеном и антителом, происходящие invitro.

Серологические реакции характеризуются такими показателями, как:

чувствительность (способность реакции выявлять минимальное

6.Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ).

7.Опсоно-фагоцитарные реакции.

Серологические реакции, протекающие с укрупнением частиц в растворе электролита (РА и РП), проходят 2 стадии:

специфическую, в которую происходит взаимодействие эпитопов

(антигенных детерминант) с паратопами (активными центрами антител);

неспецифическую, когда образуется видимый конгломерат, что объясняется теорией «решетки» и предполагает взаимодействие компонентов реакции в эквивалентном количестве с участием полных антител, имеющих не менее 2-х активных центров.

Прямая РА

Является 2-х компонентной простой реакцией, при которой происходит склеивание корпускулярных антигенов сывороткой, содержащей специфические антитела, в растворе электролита с выпадением хлопьевидного осадка и просветлением реакционной жидкости.

Компоненты:

1.Антиген, представляющий собой взвесь микроорганизмов.

2.Антитело, содержащееся либо в исследуемой сыворотке, либо в диагностической агглютинирующей сыворотке.

Выделяют следующие целевые варианты постановки РА:

по типу Видаля (из которого выделяется модификация по Райту) —

предназначены для выявления неизвестных антител, как правило, в

сыворотках крови обследуемых (серодиагностика), реже — в моче,

ликворе и др. биологических жидкостях с помощью диагностических препаратов, называемых диагностикумами (коммерческие препараты,

представляющие собой в данном случае убитую взвесь известных микроорганизмов);

по Груберу — для идентификации микробных антигенов при использовании диагностических агглютинирующих сывороток.

Методические варианты постановки прямой РА:

реакция агглютинации на стекле (слайд-агглютинация),

развернутая (пробирочная) агглютинация.

Реакция агглютинации на стекле (слайд-агглютинация)

относится к качественным способам и используется преимущественно в модификации Грубера (чаще при серотипировании энтеробактерий,

вибрионов); этот вариант может быть использован и для выявления антител,

например, к возбудителям бруцеллеза (реакция Хеддельсона), туляремии.

При постановке РА по Груберу на предметное стекло наносят 1

каплю изотонического раствора хлорида натрия (ИХН) для контроля антигена и 1 каплю диагностической агглютинирующей сыворотки в рабочем разведении. Затем в каждую каплю вносят антиген (например, петлю суточной исследуемой бактериальной культуры), и перемешивают круговыми движениями до получения равномерной взвеси. Учет производят через 3-5 мин. при комнатной температуре. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают появление хлопьев, при отрицательной – жидкость остается равномерно мутной, как и в контроле с ИХН (рис.17).

Контроль антигена выполняют с целью исключения спонтанной

(неспецифической) агглютинации антигена, без его взаимодействия с антителами. Такую агглютинацию дают, например, R-формы бактерий.

Рис.17. Учет реакции слайд-агглютинации Следует учитывать, что слайд-агглютинация может дать ложно-

положительный результат ввиду использования для ее постановки достаточно концентрированных сывороток, возможно, с наличием перекрестно-реагирующих антител; поэтому, как правило, результаты слайд-

агглютинации должны быть подтверждены в развернутой РА.

Развернутая (пробирочная) агглютинация - количественный вариант, позволяющий установить уровень антител с помощью величины,

называемой «титром».

Титр сыворотки - это максимальное ее разведение, (или минимальное количество антител), при котором еще наблюдается положительный результат реакции.

Техника постановки РА по Видалю

Для проведения реакции исследуемую сыворотку разводят ИХН 1:50

для исключения неспецифической (ложноположительной) агглютинации.

В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы –

взвеси заведомо известных убитых и в отдельных случаях живых микроорганизмов (рис.18).

Учет РА проводят через 18-24 ч. по 4-х крестной системе в

зависимости от выраженности хлопьевидного осадка и степени прозрачности надосадочной жидкости:

«++++» - полная агглютинация (хлопья агглютината в осадке,

надосадочная жидкость прозрачна);

осадке, надосадочная жидкость мутная);

«-» - отсутствие агглютинации (хлопьев агглютината в осадке нет,

надосадочная жидкость мутная).

При оценке результатов РА по типу Видаля регистрируемый титр антител сравнивают с диагностическим — эмпирически установленным минимальным уровнем антител, позволяющим подтвердить диагноз данного заболевания. Величина диагностического титра различается в зависимости от вида инфекции, типа серологической реакции, возраста обследуемого.

При интерпретации результатов развернутой РА Грубера зарегистрированный титр антител сравнивают со стандартным титром коммерческой агглютинирующей сыворотки, строго установленным при ее изготовлении напредприятии.

Область применения прямых РА.

РА просты в постановке и учете, не требуют дорогостоящего оборудования. Однако они не отличаются высокой чувствительностью,

поэтому область их использования достаточно ограничена:

серодиагностика узкого спектра инфекций (например,

коклюша,бруцеллеза, туляремии);

серотипирование бактерий в процессе бактериологического исследования;

оценка напряженности противококлюшного иммунитета.

Непрямые РА Непрямые РА относят к 2-х компонентным, но сложным реакциям,

поскольку в них один из компонентов адсорбирован на инертных частицах,

необходимых для визуализации результатов. Так, для РПГА в качестве частиц выступают формалинизированные эритроциты, для ЛА - частицы латекса,

КоА - белок А S.aureus. При взаимодействии растворимых антигенов с комплементарными антителами происходит склеивание частиц и образование видимого продукта. РПГА ориентирована в большей степени на определение антител, а ЛА и КоА — микробных антигенов непосредственно в материале от пациентов, что позволяет использовать данные виды реакций при экспресс-диагностике.

РПГА

по Бойдену - компонентами-участниками являются неизвестные антитела и антигенный эритроцитарный диагностикум (рис.19);

по Рыцаю - компонентами являются неизвестный антиген и антительный эритроцитарный диагностикум.

дез.раствор Рис. 19. Схема постановки РПГА по Бойдену

Реакцию ставят в 96-ти луночных полистироловых планшетах,

используя в качестве раствора электролита забуференные физ.растворы (ЗФР)

различного типа.

Учет РПГА проводят по системе «+» - «-» в зависимости от образования осадка эритроцитов в лунке полистиролового планшета в виде

«зонтика» или «пуговки» через 1,5-2 ч. с момента постановки, в то время как при ЛА и КоА продукт реакции носит характер хлопьевидного агглютината на стекле или специальных подложках, с временем формирования 1-2 мин.

РПГА по Бойдену применяется при диагностике многих инфекций, при оценке напряженности противодифтерийного, противостолбнячного и противокоревого иммунитета. Вариант по Рыцаю используется редко,

например, для регистрации белковых токсинов клостридий ботулизма,

стафилококкового энтеротоксина в крови обследуемых, капсульного антигена иерсиний чумы.

Реакции преципитации Реакцией преципитации (РП) называется осаждениеиз раствора

антигена при воздействии на него антитела в виде помутнения (преципитата).

Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации) и полужидком агаре (иммунодиффузия по Оухтерлони,

Манчини, иммуноэлектрофорез).

Реакция кольцепреципитации

Компоненты:

1. Антиген (искомый) - содержится в исследуемом материале

(экстракты органов и тканей, бактериальных клеток, фильтра-ты патологического материала).

2. Антитело – стандартная преципитирующая сыворотка.

Применение:

Реакция кольцепреципитации применяется для диагностики инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляремия и др.);

выявления фальсификации пищевых продуктов (мясных, рыбных, мучных изделий, молока и др.); для определения видовой принадлежности белка

(кровяных пятен, спермы и др.) в судебной медицине.

Реакция иммунодиффузии

Основана на взаимодействии гомологичных антител и антигенов в агаровом геле с образованием видимых полос преципитации. Антиген и антитело в результате встречной иммунодиффузии в гель образуют макромолекулярные иммунные комплексы, регистрируемые визуально в виде белых (опалесцирующих) полос.

При наличии в растворе нескольких антигенов, диффундирующих независимо друг от друга, количество полос соответствует количеству антигена. Серологически родственные антигены образуют полосы преципитации, сливающиеся друг с другом, полосы же разнородных

антигенов перекрещиваются. Это позволяет определить общность антигенной структуры различных исследуемых объектов.

Постановка реакции:

Реакцию ставят в чашках Петри или на предметных стеклах, залитых прокипяченным и остуженным 0,8-1% раствором специального агара или агарозы слоем толщиной 1-2 мм. В центральную лунку вносят заведомо известную преципитирующую сыворотку, а в периферические – растворы

(экстракты) антигенов, молекулы которых будут диффундировать в агар навстречу антителам преципитирующей сыворотки. Наблюдение за результатами реакции ведут в течение 2-3 суток. Отмечают количество и место образовавшихся линий преципитации, устанавливая таким образом наличие специфически реагирующих систем антиген-антитело. Этим же методом можно определить идентичность исследуемых антигенов.

Пример учета реакции:

5 4

1.Между антигенами 1 и 2 образовались непересекающиеся линии преципитации, что свидетельствует о полной идентичности этих антигенов по отношению к преципитирующей сыворотке и друг к другу.

2.Между антигенами 2 и 3 образовались частично перекрещивающиеся линии преципитации, что свидетельствует о частичной идентичности этих антигенов по отношению друг к другу и их родстве с преципитирующей сывороткой.

3. Между антигенами 3 и 4 образовались полностью

перекрещивающиеся линии преципитации, что свидетельствует о полной неидентичности этих антигенов по отношению друг к другу.

4. Между антигеном 5 и преципитирующей сывороткой линии преципитации отсутствуют, что свидетельствует об отсутствии ихродства.

Применение:

Реакция иммунодиффузии широко используется в диагностике заболеваний, вызываемых вирусами, риккетсиями и бактериями,

продуцирующими экзотоксины. Большое практическое значение реакции иммунодиффузии имеет при определении токсигенности коринебактерий дифтерии.

Реакция иммуноэлектрофореза (РИЭФ) позволяет провести анализ и идентификацию отдельных антигенов в многокомпонентной системе. РИЭФ основана на электрофоретическом разделении антигенов в геле с последующей их преципитацией антителами иммунной сыворотки. В основе РИЭФ лежит явление миграции антигенов и антител в электрическом поле навстречу друг другу, в результате чего в месте их взаимодействия образуются дугообразные линии их преципитации, количество,

расположение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

Реакции нейтрализации

При соединении антигенов и антител в случае их комплементарности происходит блокада повреждающего действия микробов и их токсинов антителами. При введении указанной смеси антиген-антитело в организм животных или чувствительные биологические объекты (куриный эмбрион,

культура тканей) отсутствие повреждающего действия свидетельствует о его нейтрализации антителами.

Методы иммуноанализа Преимуществами методов иммуноанализа по сравнению с другими

группами серологических реакций являются: высокие специфичность и чувствительность; стандартность; автоматизация процесса; возможность регистрации низкомолекулярных белков.

Область применения:

иммунодиагностика инфекционных заболеваний бактериальной,

вирусной, паразитарной этиологии;

иммунодиагностика неинфекционной патологии (аллергические,

аутоиммунные заболевания, иммунодефициты, опухоли и др.);

оценка иммунного статуса,

оценка напряженности противоинфекционного иммунитета

иммуногенетические исследования.

Несмотря на очевидные преимущества этих методов и обширную область использования в практике, они требуют наличия дорогостоящего оборудования и диагностических тест-систем.

ИФА, РИА и МФА принципиально отличаются между собой системой меток, ковалентно соединяемых с одним из компонентов-участников, и

способами регистрации результатов. Так, в ИФА используется ферментная метка (пероксидаза хрена) и хромогенный субстрат (ТМБ - 3,5-

тетраметилбензидин), изменяющий цвет при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазы, что определяет использование приборов,

работающих на принципе спектрофотометрии, для учета результатов по регистрации оптической плотности пробы; для РИА - радиоактивная метка

(I125) с регистрацией радиоактивности комплекса с помощью гамма-счетчика,

а для МФА — флюорохромы и металлы лантаноидной группы, способные флюоресцировать при облучении сине-фиолетовым спектром (ФИТЦ — флюоресцеина изотиоционат натрия), с регистрацией в люминесцентном микроскопе.

ИФА

Существуют множество вариантов постановки ИФА, которые подразделяются на:

гомогенные, когда оба компонента (антиген и антитело) находятся в жидкой фазе, отличающиеся простотой и быстротой постановки, но в то же время ориентированные только на качественный анализ и определение низкомолекулярных белков;

гетерогенные, или твердофазные (ELISA - Enzyme-Linked immunosorbent Assay), в которых один из компонентов фиксируется на твердой фазе,

наиболее часто используемые в лабораторной практике.

Вкачестве «твердой фазы» используют полистироловые или поливиниловые планшеты с плоским дном, шарики, пленки или пробирки,

обладающие высокой сорбционной способностью, в лунках которых адсорбируют антигены (или антитела). При последовательном добавлении к связавшимся с полистиролом антигенам или антителам других компонентов реакции, образуется иммунный комплекс, который выявляется с использованием ферментативной реакции.

Основные варианты твердофазного прямой ИФА,

непрямой ИФА, «сандвичи-ИФА».

Непрямой ИФА (рис. 20) – предназначен преимущественно для выявления искомых антител в сыворотке крови обследуемых. Широко используется для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний (аллергических - определение общего IgE и специфического IgE

кразличным аллергенам, аутоиммунных заболеваний - определение антител

кинсулину, ДНК, аутоантигенами др., онкологических), оценки иммунного статуса.

Компоненты:

1)антиген – стандартный препарат, который в производственных условиях сорбирован на планшете;

2)искомые антитела – содержатся в сыворотке крови иди других образцах от обследуемых;

3)неспецифический конъюгат – антитела любого вида животных против Fc-фрагмента человеческих антител, меченые ферментной меткой;

4) субстратно-индикаторная смесь, состоящая соответственно из перекиси водорода в малой концентрации и ТМБ (3,5-тетраметилбензидин) -

хромогенного индикатора, изменяющего цвет при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазной метки.

субстратно-индикаторная смесь неспецифический конъюгат искомые антитела

известный антиген планшет

Рис. 20. Схема непрямого ИФА

Техника постановки

Последовательность внесения в лунки планшета компонентов при постановке различных вариантов ИФА однотипна и включает этап сорбции

«базового» компонента на твердой фазе, а затем этапы «контакта» последовательно вносимых компонентов, после каждого из которых выполняют промывку планшета для удаления не связавшихся компонентов реакции. Учет ИФА проводят по изменению цвета реакционной смеси в лунках только с использованием приборов (мультискана или ридера),

измеряющих оптическую плотность в каждой из лунок.

Одной из модификаций ИФА и хорошей альтернативой является

Dot–ИФА. Это метод точечного иммуноферментного анализа (dot-Elisa-

точечный твердофазный иммуноферментный анализ), позволяющий снизить стоимость диагностических процедур и не требующий дорогого оборудования. В dot-ИФА минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Субстраты, дающие нерастворимые продукты ферментативной реакции, на белом нитроцеллюлозном фильтре в присутствии индикатора образуют легко различимые цветные пятна, в

результате чего отпадает нужда в дорогих фотометрах. Фильтры с результатами анализа можно хранить в темноте в течение многих лет.

Простота постановки позволяют использовать ее как экспресс-метод, в

полевых или домашних условиях. Метод dot-ИФА позволяет определять как антигены живых или разрушенных вирусов и бактерий, так и антитела.

РИФ (МФА)

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний

(чума, туляремия, бруцеллез, хламидиоз, туберкулез и др.), а также для оценки иммунного статуса (определение СD-антигенов клеток иммунной системы).

Варианты РИФ (МФА)

Прямой МФА (рис. 21) – предназначен для выявления искомых антигенов с помощью моноклональных антител, меченых флюорохромом ФИТЦ. При наличии в исследуемом материале искомых антигенов наблюдается свечение образовавшегося иммунного комплекса,

регистрируемое в люминесцентном микроскопе. Недостатком этого метода является необходимость приготовления широкого набора специфических антител против каждого изучаемого антигена, меченых ФИТЦ.

ФИТЦ-меченые моноклональ- ные антитела против искомого антигена

искомый антиген

Рис. 21. Схема прямого МФА

Непрмой МФА (рис. 22) – более сложная реакция, предназначенная для обнаружения искомых антигенов или, реже, антител. На первом этапе реакции искомый антиген связывается со специфическими кроличьими

антителами, на втором – образовавшийся комплекс соединяется с ФИТЦ-

меченой сывороткой против Fc-фрагмента иммуноглобулинов кролика

(антивидовой конъюгат), которую получают путем иммунизации ослов,

лошадей и других животных кроличьими антителами. При положительном результате реакции наблюдают свечение, которое регистрируют с помощью люминесцентной микроскопии. Удобство использования этого метода состоит в том, что антивидовые конъюгаты универсальны – они могут использоваться для обнаружения любого антигена.

антивидовой конъюгат специфические кроличьи антитела искомый антиген

Рис. 22. Схема непрямого МФА

Иммуноблоттинг

Высокочувствительный метод, основан на сочетании электрофореза

(разделение антигенов по молекулярной массе) и ИФА (или РИА).

Используется при диагностике ВИЧ-инфекции.

Оценка состояния иммунной системы

Иммунным статусом (иммунореактивностью) называют структурное и функциональное состояние иммунной системы индивидуума, определяемое комплексом клинических и лабораторных иммунологических показателей.

Сила и форма иммунного ответа на один и тот же объект у разных людей может варьировать в широких пределах, а у одного и того же человека

- в различные периоды жизни и время суток — в зависимости от биоритмов,

обусловленных, например, колебаниями гормонального фона.В связи с этим при оценке иммунного статуса возможен большой размах колебаний иммунологических параметров даже в условиях физиологической нормы, с

возможным коэффициентом вариации до 30%.

Показания к оценке иммунного статуса: трансплантации органов и тканей; выявление различных видов иммунопатологии; хронически текущие инфекционные и ряд соматических заболеваний; злокачественные новообразования; проведение цитостатической, иммунодепрессивной и иммуномодулирующей терапии; подготовка операциям, к ЭКО и др.

Оценка иммунного статуса базируется на комплексе показателей:

данных иммунограммы, клинического обследования (сбор анамнеза,

врачебный осмотр, рентгенологические, аппаратные обследования, клинико-

лабораторные методы (анализ крови, анализ мочи и т. п.).

Иммунограмма — это совокупность лабораторных методов иммунологического исследования крови или других биологических жидкостей, отражающих состояние различных звеньев иммунной системы человека.

Одни и те же иммунологические тесты, входящие в структуру иммунограммы, можно группировать на основе различных принципов.

Наиболее распространенными являются подразделения на тесты I уровня

(ориентировочные) и II уровня (функциональные).

Тесты 1 уровня могут быть выполнены в любой клинической им-

мунологической лаборатории первичного звена здравоохранения и позволяют выявить грубые нарушения со стороны иммунной системы.

Кпоказателям иммунограммы I уровня относят определение:

1)количества популяций и субпопуляций лимфоцитов: общее количество

(абсолютное в г/л и относительное в %) Т-лимфоцитов (СD3+), Th (СD4+), ЦТЛ (СD8+), NK (СD16+), В-лимфоциты (СD19+/СD20+);

2)концентрации сывороточных иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM);

3)фагоцитарной активности лейкоцитов;

4)сывороточного титра комплемента;

5)дополнительно - уровень ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов) при оценке аутоиммунных, лимфопролиферативных,

хронических инфекционных заболеваний.

Информативным показателем является иммунорегуляторный индекс

(ИРИ) - сопоставление количества субпопуляций Т-лимфоцитов — СD4+Тh

и СD8+ в периферической крови (в нормесоставляет 1,6-2,2).

Определение содержания популяций и субпопуляций клеток иммунной системы, маркеров активации лимфоцитов и ряда других показателей при постановке иммунограммы основано на взаимодействии меченных флюоресцентной меткой моноклональных антител с соответствующими CD-

антигенами клеток.

Для детекции образующихся иммунных комплексов используют 2

основных методических приема:

1)люминесцентную микроскопию (непрямой МФА);

2)проточную цитофлюориметрию (the flowcytofluorimetry).

Наиболее точным, автоматизированным методом является проточная цитофлюориметрия. Метод основан на пропускании через суспензию клеток иммунной системы лазерного излучения и регистрации в проточном цитофлюориметере (рис.23):

1)связывания клеток иммунной системы смеченными флюорохромами моноклональными антителами к поверхностным маркерам данной популяции или субпопуляции;

2)физических свойств этих клеток (диаметра ядра, размера и гранулярности клетки)

Рис.23. Проточный цитофлюориметр

Фотодетекторы преобразуют фотоны света в электронные сигналы,

которые анализируются компьютером. Клетки выявляются на плотах -

гистограммах, отображающих клеточные скопления с одинаковыми параметрами рассеивания света и спектра флюоресценции (рис.24). В

зависимости от типа флюорохрома, который использовался при конъюгировании с моноклональными антителами, флюоресценция может иметь разный спектр, например, зеленый, жёлто-оранжевый. Каждая клетка может быть помечена одновременно, по крайней мере, четырьмя маркерами.

Рис.24. Гистограммы распределения Т-клеток и их субпопуляций, полученные в результате многоцветного анализа лимфоцитов

периферической крови с использованием комбинации моноклональных антител CD3/CD4/CD8/CD45

Тесты II уровня позволяют провести более тщательный анализ

иммунного статуса и уточнить характер дефекта, выявленного на

предыдущем этапе с помощью тестов 1 уровня. Они направлены на оценку

функциональной активности лимфоцитов:

выявление пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов иих адаптационного резерва проводят в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) под действием стимуляторов — митогенов или специфических антигенов с последующим подсчетом количества по-

лучаемых бластных форм.

регистрация CD-маркеров активации лимфоцитов (СD69, СD25,

СD71, HLA-DR, СD23, СD95);

определение уровней цитокинов, секретируемых клетками иммунной системы в ИФА, а также проточной лазерной цитофлюориметрии;

определение компонентов комплемента.

При интерпретации результатов иммунограммы следует иметь в

виду ряд важных моментов:

1)решающее значение в постановке диагноза имеют клинические данные,

иммунограмма несет вспомогательное диагностическое и прогностическое значение;

2)необходимо сопоставлять абсолютные и относительные (процентные)

значения иммунологических показателей, учитывать данные общего анализа крови и предполагаемую стадию иммунного ответа;

3)первоочередное значение при оценке иммунограммы имеет соотношение комплекса показателей иммунограммы;

4)однотипные изменения показателей иммунограммы могут наблюдаться при принципиально разных патологических процессах;

5)необходим учет индивидуальных особенностей пациента (возраста,

пола и др.).

Иммунопатология

Иммунопатология – это раздел иммунологии, изучающий патологические процессы и болезни, связанные с нарушением функционирования иммунной системы, их диагностику и лечение.

Основные типы иммунопатологических процессов:

1)ослабление функций иммунной системы при дефектах одного или нескольких звеньев иммунной системы (иммунодефициты);

2)избыточное реагирование иммунной системы преимущественно на экзогенные антигены (аллергическая гиперчувствительность);

3)неправильное реагирование иммунной системы на эндогенные антигены

(аутоиммунные заболевания);

4)лимфопролиферативные заболевания (опухоли иммунной системы).

Иммунодефициты

Иммунодефицитами (ИД) называют устойчивые изменения иммунного статуса, обусловленные дефектами (выпадением или недостаточностью)

функций одного или нескольких механизмов иммунного ответа.

По происхождению иммунодефициты классифицируются на:

1)первичные (врожденные);

2)вторичные (приобретенные);

3)физиологические (возрастные – у новорожденных, при старении;

при беременности и лактации).

Первичные иммунодефициты (ПИД) — врождённые нарушения иммунной системы, обусловленные дефектами в генах, ответственных за её нормальное развитие.

В МКБ-Х представлена классификация ПИД, объединяющая около 150

синдромов. Она основана на преимущественном поражении того или иного звена иммунитета. Иммунодефициты с поражением В-системы характеризуются недостаточностью антител; они наиболее часто - до 70% -

регистрируются среди населения (избирательный дефицит IgA,

наследственная гипогаммаглобулинемия - болезнь Брутона и др).

Комбинированные ПИД (например, тяжелый комбинированный иммунодефицит с низким содержанием T- и B-клеток) и иммунодефициты,

сочетанные с другими значительными дефектами (иммунодефицит с карликовостью, синдром Ди Георга и др.) затрагивают несколько систем,

протекают обычно тяжело.

В зависимости от формы ПИД имеют разнообразные клинические симптомы, однако во всех случаях лидирующее положение занимает инфекционный синдром - наличие частых инфекционных заболеваний. В

случае ПИД с недостаточностью антителообразования преобладают бактериальные инфекции, при дефектах преимущественно Т-звена -

заболевания вирусной и грибковой этиологии. Инфекционный синдром может сочетаться с лимфопролиферативным, аллергическим, аутоиммунным,

кишечным, гематологическим и пороками развития.

Основные диагностические критерии для постановки диагноза

«ПИД»:

1)наличие частых инфекционных заболеваний, обычно с отсутствием эффекта от длительного применения антибиотиков - заболевания верхних дыхательных путей у дошкольников более 9 раз в год, у

школьников — более 6, в старшей возрастной группе — более 4 раз в год; более 2 синуситов или более 2 пневмоний в год; наличие

одновременно более 2 тяжёлых инфекций (сепсис, остеомиелит,

менингит и другие); обнаружение атипичных возбудителей (пневмоцист

и др.); повторяющиеся гнойные процессы в коже;

2)наличие в семейном анамнезе смертей в раннем возрасте от инфекционных заболеваний, подтвержденный у родственников диагноз

«ПИД»;

3)данные иммунограммы (отклонения в количестве Т- и В-лимфоцитов,

концентрации Ig классов G, M, A, комплемента и др.);

4)результаты генетических тестов.

Вторичные иммунодефициты (ВИД) – это нарушения иммунной системы, имеющие клинические проявления, развивающиеся преимущественно в постнеонатальном периоде и не являющиеся результатом генетических дефектов.

ВИД характеризуются:

1)развитием на фоне ранее нормального функционирования иммунной системы, оцениваемой по клинико-лабораторным показателям;

2)очевидной связью с причинным фактором;

3) риском развития хронических инфекций, опухолей, аутоиммунных,

аллергических болезней.

Основные факторы формирования ВИД:

1) окружающей среды: (климато-географические, «промышленные», радиационный фон и др.);

2) патологические: при хронических соматических и инфекционных заболеваниях, в том числе приводящих к эндогенным интоксикациям; травмах (в том числе ожогах, кровопотерях); как результат действия специализированных облигатно-лимфотропных вирусов (ВИЧ, вируса Эпштейн-Барра и др.);

3) особенности индивидуальной жизни (социальные): бытовые,

характер питания, сильные длительные стрессы; наличие вредных

привычек и др.