Техника выполнения

Кровь для анализа (приложение 3) необходимо брать с антикоагулянтом (цитрат или ЭДТА — этилендиаминотетрауксусная кислота). Крайне важно, чтобы в среде, находящейся пробирке, содержался агент, вызывающий хелатирование кальция. В образце крови он провоцирует неспецифическую фиксацию комплемента на эритроцитах в условиях in vitro и приводит к ложно позитивной реакции. Именно поэтому гепарин не используют в качестве антикоагулянта.

Приложение 3. Диагностика иммунопатологии на практике

Взятие крови: цельная кровь с антикоагулянтом, обязательно с цитратом, ЭДТА (Complexon), ACD, CPD. Объем — 1 мл (минимум) — 5 мл.

Доставка: быстрая, оптимальное время транспортировки 2-6 часов. Ни в коем случае не превышать 48 часов.

Анализ: прямой тест Кумбса.

Постановка метода: сразу после получения образца крови.

Срок предоставления результатов: в течение одного дня с момента получения материала для анализа

После тщательной отмывки (трех или пятикратное центрифугирование от 5 мин при 800g до 5 мин при 1500g) тестируемый образец суспензии доводят до 2%-ой концентрации. Прямую реакцию Кумбса рекомендуется проводить как можно раньше с момента взятия материала, желательно в течение 2 часов. Образец крови следует хранить при температуре 37°С. После инкубации в течение одного часа при 37°С с разными серийными разведениями трех антисывороток образец выдерживают в условиях комнатной температуры (1-1,5 часа). Результаты реакции учитывать визуально в лунках микроплашек, помещенных на зеркало Кана, либо с помощью микроскопа (×100).

Параллельно необходимо проводить негативные контроли:

2%-ная суспензия эритроцитов больного в присутствии изотонического раствора NaCl с целью проверки способности тестируемых эритроцитов на спонтанную агглютинацию в отсутствие антиглобулинов. По данным Desnoyers M. (1992), аутоагглютинины отвечают за спонтанную аутоагглютинацию как при 37°С (класс I), так и при 4°С (класс IV). У кошек аутоагглютинация эритроцитов встречается часто (Shabre B., 1990). Разведение крови в эквивалентном объеме изотонического раствора NaCl позволяет исключить указанный артефакт за счет диссоциации эритроцитов, имеющих форму трубочек, не оказывая при этом негативного эффекта на настоящие аутоагглютинины (Squire R., 1993).

Смешивание 2%-ной суспензии эритроцитов здоровой собаки (контрольное животное) с видоспецифическим сывороточным антиглобулином позволяет проверить качество антисыворотки.

Если клинические симптомы указывают на АГА, опосредованную IgM, то клиницист может затребовать проведение обычной пробы Кумбса при 37°С, а также холодовой пробы Кумбса при 4°С, чтобы выявить антитела, активные на холоде (типы IV и V) (Vandenbussche P., et al., 1991).

Этот тест не приемлем для кошек. Дело в том, что у многих нормальных кошек есть неагглютинирующие антитела, которые становятся активными в условиях более низкой температуры и выявляются с помощью прямого теста Кумбса при 4°С. У данного вида животных следует использовать метод непрямой гемагглютинации при 4°С.

Обсуждение

Лабораторная диагностика АГА почти полностью основана на прямом методе Кумбса в сочетании с общим анализом крови. Интерпретация положительной реакции в тесте Кумбса не вызывает сложности.

Если обнаруженные антитела относятся к классу IgG, то весьма вероятно, что выявленная анемия имеет аутоиммунное происхождение.

Значимость выявления положительного результата в пробе Кумбса типа «IgG+комплемент» при АГА смешанного типа требует обсуждения, поскольку нет полной уверенности в том, что комплемент фиксируется на комплексе, образованном IgG с антигенами мембраны эритроцитов.

Оказалось, что еще сложнее установить достоверность сенсибилизации эритроцитов при АГА, выявляемой с помощью позитивного теста Кумбса в постановке реакции на «чистый комплемент».

Возможно, часть тестов Кумбса типа «комплемент» соответствует временной фиксации комплексов антиген-антитело, которые быстро элюируются с поверхности эритроцитов.

Дифференцируют АГА от истинного гипергемолиза по следующим признакам: повышенный ретикулоцитоз, неконьюгированная гипербилирубинемия и т.д. Иногда тест Кумбса дает ложно-позитивный или ложно-негативный результат (табл. 4). Это бывает довольно редко (примерно в 2% случаев), но негативная реакция на тест Кумбса может проявляться при истинной АГА, особенно если количество фиксированных иммуноглобулинов недостаточно (менее 500 на один эритроцит).

Таблица 4. Интерпретация результатов прямого метода Кумбса (по Cotter)

Ложно-позитивные реакции	1. Антитела, фиксированные на эритроцитах и специфичные к бактериям, паразитам. (Haemobartonella, Babesia) или лекарственным препаратам. 2. Неспецифическая адсорбция сывороточных белков поврежденными эритроцитами. 3. Неоплазии (адсорбированные иммунные комплексы). 4. Антисыворотки с антитрансферриновой активностью 5. Переливания крови (посттрансфузионные аллоантитела). 6. Присутствие свободных ионов Са++ в пробирке с образцом взятой крови (гепарин): не иммунная (неспецифическая) фиксация комплемента на эритроцитах.
Ложно-негативные реакции
Технические проблемы	1. Спонтанное элюирование антител при отмывании или слишком долгая задержка с доставкой образца крови. 2. Антисыворотки, не адаптированные по титру или специфичности (отсутствие видовой специфичности). 3. Антисыворотки со слишком высоким титром: повышать разведение. 4. Температура тестирования отличается от температуры активизирующей антитела — холодовые агглютинины (IgM) выявляют исключительно при 37°С.
Биологические проблемы	5. Пациент находится в фазе ремиссии. 6. Слишком малое количество антител фиксирующихся на эритроцитах (ниже порога чувствительности используемого метода): 100-500 IgM/эритроцит. 7. Подавление антител в процессе лечения.

Клинические симптомы АГА во многом сходны с пироплазмозом, очень распространенным во Франции. Это требует от клинициста систематического проведения теста Кумбса в случае гемолитической анемии при отсутствии положительного ответа на классическое лечение, при заболевании животного пироплазмозом, даже если установлена персистенция пироплазм в крови, потому что это заболевание может одновременно сопровождаться АГА.

Элюирование

Если с помощью метода Кумбса можно определить, к какому классу относятся сенсибилизированные антитела, то элюирование позволяет определить их специфичность. Элюирование при высокой температуре с помощью эфира или кислоты позволяет собрать пул антител и протестировать их на панели с эритроцитами соответствующего вида с помощью непрямого метода Кумбса (Person J.M., 1988).

Это в основном проводят в гуманитарной медицине, где имеются панели с типированными эритроцитами.

У животных элюирование кислотой имеет особенное значение при подозрении на ложно-позитивную реакцию специфических антител к антигену, искусственно фиксированному на поверхности эритроцитов. Если элюат, полученный от эритроцитов собаки, подозреваемой на заболевание, не дает реакции агглютинации с пулом эритроцитов, полученных от собак с различными группами крови, то речь идет об АГА (Tsuchida et al., 1991).