- •Иммунология : практикум : учеб. Пособие / [Ковальчук л. В. И др.] - 2010. - 176 с. : ил.
- •1.1. Инбредные животные
- •1.2. Линии мышей с генетическими дефектами, затрагивающими иммунную
- •1.3. Линии мышей с аутоиммунной
- •1.4. Биологические материалы
- •1.5. Методические особенности работы
- •Глава 2 Методы разделения клеток периферической крови человека
- •2.1. Выделение лейкоцитов
- •2.2. Выделение мононуклеарных клеток
- •2.3. Выделение моноцитов
- •2.4. Выделение нейтрофилов
- •2.5. Аналитическая и препаративная цитофлуориметрия
- •2.6. Иммуномагнитная сепарация клеток
- •Глава 3. Методы изучения функциональной активности клеток иммунной системы in vitro и in vivo
- •3.1. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов
- •3.2. Оценка клеточной цитотоксичности
- •3.3. Оценка функциональной активности
- •Глава 4 Иммуноанализы
- •4.1. Методы определения преципитатов антител с антигенами в геле
- •4.2. Иммуноферментный и радиоиммунный
- •4.3. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность тест-систем иммуноанализов
- •4.4. Определение количества клеток, секретирующих тот или иной продукт, - метод elispot
- •4.5. Методы исследования внутриклеточных цитоплазматических и ядерных белков - факторов транскрипции, сигнальных молекул и других
- •Глава 5
- •Глава 6. Генетическая методы исследования в иммунологии.
- •6.1. Полимеразная цепная реакция
- •6.2. Исследование экспрессии генов методом микрочипов
- •6.3. Получение мышей с нокаутом
- •6.4. Применение регуляторных микро-рнк в иммунологических исследованиях
- •Глава 7
- •I. Оценка клеток-продуцентов.
- •II. Оценка цитокинов и их антагонистов в биологических средах организма.
- •III. Оценка клеток-мишеней.
4.3. Чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность тест-систем иммуноанализов
Чувствительность иммуноанализов
Термин «чувствительность» применительно к иммуноанализам имеет два разных смысла.
1. Чувствительность в физико-химическом понимании - это определяемая данным анализом минимальная концентрация искомого вещества в пробе. Как правило, для большинства ИФА-тест-систем такая чувствительность составляет нанограммы в миллилитре.
|
2. Второе понимание термина «чувствительность» - популяционное и относится к диагностическим тест-системам, предназначенным для выявления тех или иных маркеров заболеваний, чаще всего инфекционных.
При разработке любой тест-системы пользуются биологическим материалом, скажем, пробами крови людей, заведомо больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно позитивными), и людей, заведомо не больных данным заболеванием (эти пробы называют истинно отрицательными).
Параметры рассчитывают по приведенным ниже формулам, где N - число тех или иных результатов конкретных анализов на биологическом материале от пациентов с достоверно известными диагнозами.
Чувствительность иммуноанализа в данном случае - это параметр, всегда привязанный к конкретной тест-системе, а не только к принципу метода. Чувствительность зависит от аффинности и авидности взаимодействия используемых (или искомых) антител с искомым (или используемым) антигеном, от других реагентов, включенных в систему, от времени и температуры инкубаций.
Поскольку связывание антител с антигенами не подчиняется линейным зависимостям, то в целях попадания в «зоны эквивалентности» практически во всех вариантах иммуноанализов принято так называемое титрование сывороток или растворов антигенов, т.е. сыворотки (или растворы антигенов) разводят известным образом (двукратные, пятикратные, десятикратные или иные разведения) и каждое из разведений пускают в иммуноанализ. Для того чтобы установить нижнюю границу достоверных признаков связывания антител с антигеном (cut-off - граница отличия отрицательных результатов от положительных), в каждой постановке иммуноанализов обязательно применение заведомо отрицательных и заведомо положительных контрольных сывороток. Если целью анализа является определение не титров сывороток, а численных концентраций искомых антител или антигенов, то прибегают к калибровке. Для этого тест-система должна располагать калибровочными растворами (от 3 до 10 точек), содержащими известные нарастающие концентрации искомого вещества, а система регистрации результатов тоже должна быть «оцифрована», например в единицах оптической плотности, измеряемых спектрофотометрически, или в единицах флюоресцентного излучения, измеряемого флюориметрами, или в единицах числа импульсов в минуту, измеряемых счетчиками радиоактивности (в случае радиоиммуноанализов). В диапазонах прямолинейности калибровочной кривой возможно определение искомых концентраций в испытуемых биопробах.
|
Учитывая сказанное, мы приведем лишь порядок концентраций, выявляемых с помощью различных технологий иммуноанализов. При этом конкретные тест-системы в пределах одной технологии могут по чувствительности отличаться друг от друга также на порядки.
Методы преципитации, агглютинации и иммунодиффузии работоспособны при концентрациях искомых веществ порядка миллиграммов на миллилитр. Как правило, калибровочные растворы имеют диапазон концентраций от 1 до 0,1 мг/мл.
Твердофазные радиоиммуноанализы и иммуноферментные анализы работают в большинстве тест-систем в нанограммовых диапазонах концентраций (нанограммы на миллилитр). Однако ловушечные конструкции тест-систем, а также иммунометрические тест-системы могут иметь существенно более высокую чувствительность, например 10-12-15 г/мл.
Специфичность иммуноанализов
Специфичность диагностической тест-системы - параметр, характеризующий ее распознавательные возможности в отношении именно данного заболевания, которое она «не путает» с другими.
Диагностическая эффективность тест-систем
Диагностическая эффективность - это параметр, характеризующий возможности данной тест-системы одновременно правильно определять позитивные пробы как позитивные, а негативные пробы - как негативные.
Положительная и отрицательная предсказательная значимость тестсистем.
Есть еще и такие характеристики диагностических тест-систем, как положительная предсказательная значимость (ППЗ) и отрицательная предсказательная значимость (ОПЗ). Чтобы пользоваться данными характеристиками (и это отличает их от приведенных выше
чувствительности и специфичности), необходимо знание реальной распространенности данного инфекционного заболевания в обследуемых популяциях населения.
ППЗ рассчитывают как частоту встречаемости инфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как позитивные:
|
ОПЗ тест-системы рассчитывают как частоту неинфицированных людей среди всех индивидуумов, определенных данной тест-системой как отрицательные: