Реакция иммуноблотинга, реакция нейтрализации токсина антитоксином (in vivo, in vitro).
Иммуноблотинг
Электрофорезом выделяют антигены в полиакриламидном геле.
Переносят их на активированную бумагу или микропористую нитроцеллюлозную мембрану. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами».
На полоски наносят сыворотку больного.
П
осле
инкубации отмывают от антител, которые
не связались и наносят меченую
антиглобулиновую сыворотку.Комплекс АГ + АТ больного + анти-Ig выявляют, добавляя хромоген, изменяющий окраску под действием фермента.
Иммуноблотинг применяют для диагностики ВИЧ-инфекции и др.
Реакция нейтрализации токсина антитоксином
In vitro:
Реакция флоккуляции
В геле по Оухтерлони – например, для выялвения токсигенности дифтерийной палочки.
In vivo:
Введение токсина (АГ) + антитоксичекой сыворотки (АТ) в культуры клеток, эмбрионы, лабораторному животному
Отсутствует или проявляется эффект действия токсина (гибель, некроз кожи в месте введения)
Реакции с мечеными антигенами и антителами.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) (метод Кунса)
Д
ля
выявления АГ или АТ. Три разновидности:
прямая,
непрямая,
с
комплементом.
Прямая РИФ основана на том, что антигены, обработанные сыворотками с антителами, мечеными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Свечение зеленого цвета по периферии клетки.
Непрямая РИФ: выявляют комплекс АГ+АТ с помощью антиглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромом.
М
азки
из взвеси микробов обрабатывают
антителами антимикробной сыворотки,
полученной при заражении кроликов.Антитела, которые не связались с АГ микробов, отмывают, оставшиеся выявляют, обрабатывая меченной антиглобулиновой сывороткой.
В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, бета-галактоидаза).
После соединения АГ с меченной ферментом иммунной сывороткой добавляют субстрат/хромоген, который расщепляется ферментом.
В результате изменяется цвет продукта реакции
Чем интенсивнее окраска, тем больше число молекул связавшихся АГ-АТ.
Твердофазный ИФА: один из компонентов (АГ или АТ) адсорбирован на твёрдом носителе, например в лунках планшеток из полистирола.
Конкурентный вариант ИФА: искомый и меченный ферментом антигены (или АТ) конкурируют друг с другом за связывание антител (или АГ) иммунной сыворотки.
ИФА применяется для диагностики вирусных, бактериальных, паразитарных болезней (ВИЧ, гепатит В), а также для определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др. БАВ, содержащихся в исследуемом материале.
Радиоиммунологический метод (также различают твёдрофазный и конкурентный)
Реакция АГ-АТ, меченных радионуклидами: 125J, 14C, 3H, 51Cr и др.
После образования иммунного комплекса определяют его радиоактивность (β и γ излучение) счётчиком.
Чем больше интенсивность излучения, тем больше число связавшихся молекул
АГ-АТ.