Antibiotiki

21

Таблица 6 – Концентрация антибиотиков в крови (К) после введения среднетерапевтических доз препарата

2.Выраженное избирательное действие на микроорганизмы, определяемое антимикробным спектром - преимущественным действием на те или иные бактерии (грамположительные, грамотрицательные).

3.Бактериостатическое или бактерицидное действие

(микробостатическое или микробоцидное действие) - полное или частичное подавление роста и размножения бактерий или их гибель.

4.Отсутствие у бактерий способности к формированию лекарственно-

устойчивых форм.

Активность антибиотиков определяют методами, в основе которых лежит установление интенсивности прямого воздействия препарата на живую микробную клетку. Биологическая активность антибиотиков основана на подавлении роста чувствительного тест-микроба (золотистого стафилококка №209 для пенициллина, B. subtilis – для стрептомицина и тетрациклина, E. coli – для биомицина и левомицетина). Биологическая активность выражается либо в условных единицах - единицах действия (ЕД), содержащихся в 1 мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг), либо в весовом количестве активного вещества. За единицу биологической (противомикробной) активности принимается минимальное количество антибиотика, которое подавляет рост стандартного тест-микроба в определенном объеме питательной среды. Так, за единицу пенициллина принимают 0,6 мкг чистого сухого препарата, а 1 мг чистого основания стрептомицина эквивалентен 1000 ЕД, следовательно, 1 ЕД стрептомицина эквивалентна 1 мкг

23

эффективным считается уровень препарата, который в течение длительного времени при минимальной концентрации оказывает тормозящий эффект на возбудителя.

Под фармакодинамикой понимают специфическое действие препарата на макроорганизм и возбудитель, находящийся в организме. Фармакодинамика изучает также механизмы действия антибиотика, выявляет связь между концентрацией препарата и достигнутым эффектом. Антибиотик лишь воздействует на возбудителя заболевания - окончательная ликвидация инфекционного процесса происходит в результате мобилизации защитных механизмов макроорганизма.

Прежде чем назначать тот или иной антибиотик, необходимо знать его свойства, способ введения, спектр и механизм противомикробного действия, срок сохранения в организме и пути выведения из организма, а также показания к применению. Нельзя использовать антибиотикотерапию в течение длительного времени, так как продолжительный прием антибиотиков приводит к угнетению нормальной микрофлоры организма. Одновременно с этим размножается нечувствительная к антибиотику микрофлора, обусловливающая дисбактериозы, сопровождающиеся гастроэнтеритом, колитом, кандидозом и другими заболеваниями.

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

При использовании антибиотиков выраженный лечебный эффект достигается в случае применения тех препаратов, к которым возбудитель наиболее чувствителен. Определение чувствительности возбудителя к антибиотикам проводится перед началом лечения и периодически – в ходе лечения. Существует несколько методов, позволяющих определять чувствительность бактерий к химиотерапевтическим препаратам. Главным показателем чувствительности, независимо от метода ее определения, является величина минимальной ингибирующей концентрации - МИК (мкг/мл), то есть минимальная концентрация антимикробного препарата, задерживающая рост испытуемого штамма микроорганизма. Выявлена четкая корреляция между данными, полученными in vitro, и действием препарата in vivo. Установлено, что для проявления удовлетворительного терапевтического эффекта концентрация препарата в сыворотке должна в 2-4 раза превышать его минимальную ингибирующую концентрацию.

В настоящее время на практике используются следующие методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

1. Метод серийных разведений в жидких средах. В жидкие среды с серийными разведениями антибиотиков вносят исследуемую культуру, инкубируют посевы 10-18 часов при 37°С, и учитывают результаты визуально или нефелометрически. Иногда в среду добавляют глюкозу и индикатор, что позволяет учитывать результаты по изменению окраски среды. Этот метод позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) или минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата для конкретного возбудителя.

24

Исследование можно выполнять в различных объемах питательной среды - от 1 до 10 мл; в качестве питательной среды обычно используют МПБ или любую другую среду, соответствующую питательным потребностям возбудителя. В пробирках с питательной средой готовят серию двойных разведений антимикробного препарата. В качестве контроля используют пробирку с питательной средой без антибиотика. В каждую пробирку вносят физиологический раствор, содержащий 106 микробных клеток/мл. Пробирки инкубируют 10-18 часов при 37°С (или до появления бактериального роста в контрольной пробирке). По истечении указанного срока учитывают результаты. МПК соответствует наибольшему разведению препарата, тормозящему рост тест-культуры (рисунок 11).

Концентрация антибиотика, мкг/мл

0 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32

Рисунок 11 – Определение МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

2.Метод серийных разведений в плотных средах. Метод аналогичен предыдущей процедуре, но проводится на плотных питательных средах. При использовании этого метода готовят двойные серийные разведения антимикробного препарата, затем вносят каждое разведение в пробирки, содержащие охлажденную агаровую среду. Содержимое пробирки после перемешивания быстро переносят в чашки Петри либо пробирки “скашивают” до застывания агара. Затем агар засевают исследуемой стандартизированной тест-культурой (петлей или специальным дозатором). Посевы инкубируют 18-20 часов при 37°С. После инкубирования посевов определяют МИК по отсутствию роста на чашках или в пробирках, содержащих наименьшие концентрации препарата.

3.Диффузионные методы. Эти методы менее чувствительны, чем методы стандартных разведений, но проще по выполнению. На практике их применяют чаще. Следует учитывать, что скорость диффузии в агаре любого препарата зависит от его структуры, молекулярной массы, наличия примесей, состава и рН среды. Эти методы менее точны, но более просты в исполнении и позволяют определять чувствительность бактерий к нескольким антибиотикам одновременно.

Классический (исходный) метод. В чашки Петри вносят тонкий слой (4-5 мм) плотной питательной среды, соответствующей питательным потребностям

возбудителя. После застывания агар подсушивают в термостате при 37°С в течение 20 минут. Затем на поверхность агара наносят микробную взвесь (105 клеток/мл). После равномерного распределения по поверхности агара излишки суспензии удаляют, а чашки подсушивают в термостате. В агаре пробивают лунки и в каждую вносят по 0,1 мл раствора исследуемого антибиотика, после чего инкубируют 18 часов при 37°С (срок инкубации варьируют в зависимости от скорости роста

25

микроорганизмов). После инкубирования в оптимальных условиях измеряют диаметр зоны подавления роста для каждого препарата.

Метод дисков (стандартный тест, чашечный или кольцевой метод, дискодиффузионный метод) предложен Кирби и Бауэром и признан стандартным тестом. Для определения чувствительности бактерий с помощью этого метода на агар высевают исследуемую культуру (суспензия, содержащая 109 клеток/мл). После этого на поверхности агара насполагают диски из фильтровальной бумаги, пропитанные антибиотиками (используют коммерческие диски, содержащие определенные концентрации антибиотиков). Посевы инкубируют при 37°С в течение времени, необходимого для роста конкретного возбудителя. Вокруг дисков в зависимости от активности и концентрации антибиотика образуются разной величины зоны задержки роста исследуемого микроба (рисунок 12).

Отсутствие зоны подавления роста

Зоны подавления культуры роста культуры

Рисунок 12 – Схематическое изображение результатов диско-диффузионного метода определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Эти зоны измеряют с помощью циркуля и линейки. Полученные размеры зон сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкции, после чего микроорганизмы относят к той или иной группе (чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным). Показатели активности основных антибиотиков, определяемые методом стандартных индикаторных дисков, представлены в таблице 7.

Таблица 7 – Показатели активности основных антибиотиков, определенные методом стандартных индикаторных дисков

26

27

Таблица 8 – Ориентировочная (универсальная) шкала оценки чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при использовании диско-

диффузионного метода

Таким образом, если зона задержки роста составляет 15-25 мм, то микробы считают чувствительными к антибиотикам, до 15 мм - малочувствительными, а отсутствие зоны указывает на резистентность бактериальной культуры к данному антибиотику (чувствительность отсутствует). Этот метод используется только для “быстрорастущих” микроорганизмов, образующих сплошной рост на плотной питательной среде (в виде “газона”) через 18-20 часов инкубации.

4.Определение способности к образованию бета-лактамаз (бета-

лактамазный тест) - на питательную среду высевают исследуемую культуру и наносят диски, пропитанные нитроцефином - цефалоспорином, изменяющим окраску диска при гидролизе антибиотика с желтоватой на коричнево-малиновую. Этот метод пригоден только для микроорганизмов, продуцирующих бета-лактамазу.

5.Выявление метициллинрезистентных стафилококков - на питательный агар параллельными штрихами высевают культуры (исследуемую и контрольную) и наносят полоски фильтровальной бумаги, содержащие 25 мкг метициллина. При наличии чувствительности к метициллину образуются зоны задержки роста вокруг полоски.

28

6. Новые методы определения чувствительности бактерий к химиопрепаратам:

-автоматические системы учета результатов метода серийных разведений

(Baxter MicroScan Auto SCAN-4) - автоматизированные инкубационные системы со встроенными фотометрами, регистрирующими рост бактерий в лунках микропанелей. Устройство VITEK позволяет получать результаты уже через 4-10 часов;

-система Alamar представляет собой панель с лунками, в которые помещены бумажные диски с различным содержанием антибиотиков и пропитанные специальным индикатором. После внесения в лунки бактериальных суспензий диск синеет, а при их дальнейшем росте его окраска меняется на розовую;

-Е-тест - модификация метода дисков, в которой вместо дисков используется полоска, пропитанная сразу несколькими концентрациями антибиотика. Каждая зона полоски имеет соответствующую маркировку. Полоска помещается на поверхность агара с бактериальной культурой. Зона задержки роста культуры в этом тесте также имеет эллипсовидную форму. Минимальной ингибирующей концентрации антибиотика соответствует тот участок полоски, где

еепересекает зона задержки роста исследуемой культуры (рисунок 13).

Зона роста культуры

Элипсовидная зона подавления роста

МПК 2 мг/л

Рисунок 13 – Определение МПК с помощью Е-теста.

На практике величина МИК позволяет отнести исследуемый штамм микроорганизма к одной из трех общепринятых категорий:

-чувствительный микроб;

-умеренно-устойчивый микроб;

-устойчивый микроб.

Микроорганизм считается чувствительным, если у него нет устойчивости к данному средству и при лечении стандартными дозами этого препарата отмечается хорошая терапевтическая эффективность.

Устойчивым к антимикробному средству считают микроорганизм, если он имеет механизмы резистентности к данному препарату и при лечении инфекций,

29

вызванных этим микроорганизмом, нет клинического эффекта даже при использовании максимальных терапевтических доз этого препарата.

Микроорганизмы относятся к умеренно-устойчивым, если по своей чувствительности они занимают промежуточное значение между чувствительными и устойчивыми штаммами и при лечении инфекций, вызванных данными возбудителями, клинический эффект наблюдается только при использовании высоких терапевтических доз препарата.

Антибиотикорезистентность микробов

Антибиотикорезистентность – это устойчивость микробов к антимикробным препаратам. Микробы считаются резистентными в том случае, когда они не обезвреживаются такими концентрациями антибиотиков, которые создаются в организме при введении принятых доз. Таким образом, бактерии являются резистентными к препарату, если он в терапевтической концентрации не подавляет размножения этого микроорганизма. В этом случае минимальная подавляющая концентрация in vitro выше, чем в тканях или в сыворотке крови. Целый ряд микробов под влиянием антибиотиков, особенно при неправильном их применении, утрачивает чувствительность к ним и образует антибиотикорезистентные формы. В настоящее время число лекарственно-устойчивых форм бактерий повсеместно возрастает. Так, частота обнаружения пенициллиноустойчивых стафилококков доходит до 90-98%, стрептомициноустойчивых – до 60-70% и выше, резистентность шигелл к ампициллину достигает 90% и более. Устойчивость к антибиотикам чаще возникает у бактерий, реже – у спирохет, риккетсий, хламидий, микоплазм, дрожжеподобных грибов. Устойчивость к антибиотикам возникает в результате изменения различных структур бактериальной клетки (цитоплазматической мембраны, клеточной стенки, рибосом и др.).

Основные механизмы резистентности микробов к антибиотикам:

-способность к синтезу ферментов, инактивирующих антибактериальный препарат;

-модификация бактериальных структур, с которыми взаимодействует антибиотик.

Различают следующие виды резистентности микроорганизмов:

1.Естественная резистентность (первичная резистентность, природная устойчивость) - генетически обусловленная резистентность данного вида бактерий в отношении какого-либо химиотерапевтического препарата (отсутствие мишени для воздействия антибиотика). Например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувствительны к бета-лактамным антибиотикам.

2.Приобретенная резистентность:

-первично приобретенная резистентность - резистентность бактериального штамма к химиотерапевтическому препарату без предварительного контакта с антибиотиком;

-вторично приобретенная резистентность - резистентность,

развивающаяся после контакта с химиотерапевтическим препаратом.

Генетические основы приобретенной резистентности:

30

1.Мутации в бактериальной хромосоме с последующей селекцией мутантов. Такой путь приобретения устойчивости наблюдается в присутствии антибиотиков, так как в этом случае мутанты приобретают селективные преимущества.

2.Перенос хромосомных генов антибиотикорезистентности.

3.Перенос R-плазмид (плазмид резистентности). При этом плазмиды могут кодировать устойчивость сразу к нескольким антибиотикам (множественная устойчивость).

4.Перенос транспозонов (мигрирующих генетических последовательностей), несущих гены резистентности к антибиотикам (r-гены). Транспозоны способны мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, что увеличивает вероятность возникновения антибиотикорезистентных бактерий.

По интенсивности и скорости развития выделяют 2 типа развития резистентности:

- быстрое развитие резистентности (одношаговая мутация) - устойчивость к стрептомицину, эритромицину);

- медленное развитие резистентности (многошаговая мутация) - устойчивость к пенициллинам, хлорамфениколу, нитрофуранам.

Впервые явление приобретенной резистентности к различным препаратам привлекло к себе внимание в 50-60-х гг. XX в. после выявления пенициллиназопродуцирующих стафилококков и множественной устойчивости у энтеробактерий.

Резистентность, обусловленная мутациями, связана с изменением в структуре гена, кодирующего чувствительность к антибиотику. При этом возникают

как спонтанные, так и индуцированные мутации. Спонтанные мутации, наблюдаемые с частотой от 10-7 до 10-12, играют очень незначительную роль в формировании резистентности. На фоне применения антибактериального средства часто возникают индуцированные мутации. В этом случае имеет место естественная селекция антибиотикоустойчивых штаммов. Подобным путем у штаммов Staphylococcus aureus выработалась устойчивость к метициллину.

Мутации могут быть единичными, при которых возникают бактерии, устойчивые к одному какому-нибудь антибиотику, а также множественными, при которых возникает потомство, обладающее устойчивостью к нескольким антибиотикам.

Наиболее часто резистентность к антибиотикам обусловлена переносом плазмид. Плазмиды резистентности (R-плазмиды) - внехромосомные молекулы ДНК. Они способны к автономной репродукции и кодируют антибиотикоустойчивость у различных бактерий. Плазмиды могут включать один и более генов, кодирующих синтез ферментов, обусловливающих инактивацию или модификацию лекарственных препаратов (например, β-лактамазы, инактивирующие пенициллины и цефалоспорины, или ацетилтрансферазы, нарушающие структуру хлорамфеникола), а также опосредующих быструю элиминацию препаратов (например, тетрациклинов) из клетки. Гены множественной устойчивости могут кодировать транспозоны, которые у одних бактерий интегрируются в плазмиды, а у других микробов встраиваются в бактериальную хромосому. У грамотрицательных бактерий плазмиды часто опосредуют не только резистентность к нескольким