15. В каких двух направлениях используют реакции иммунитета? Перечислите реакции иммунитета.

реакции иммунитета используются: 1) для серологической диагностики (серодиагностики) заболеваний - обнаружение в сыворотке крови больных людей антител к определенному возбудителю инфекционного заболевания (известному антигену); если в сыворотке крови больного человека присутствуют антитела к какому-либо возбудителю, то именно этот возбудитель и вызвал данное инфекционное заболевание;

+2) для серологической идентификации (сероидентификации) микробов - для установления вида возбудителя заболевания при помощи иммунных диагностических сывороток (известных антител); если антитела связывают возбудителя, выделенного от больного человека, то этот микроб идентичен тому, которым иммунизировали животного при получении иммунной диагностической сыворотки.

Реакция агглютинации /РА/ - это взаимодействие корпускулярного антигена /взвеси бактерий, других "клеток или частиц/ и антител-агглютинов в изотоническом растворе с образованием и осаждением агглютината /хлопьев из склеившихся частиц/. Eе ставят несколькими методами. Быстрая ориентировочная РА ставится на предметном стекле и учитывается в течение 2-3 мин после смешивания ингредиентов и покачивания стекла. Более надежные результаты даёт использование адсорбированных и монорецепторных сывороток, что позволяет избежать неспецифических реакций, например, с родственными бактериями за счет общих антигенов. Развёрнутая /объёмная/ РА более точна, она ставится в пробирках и учитывается через сутки. В ряду пробирок готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в ИХН - 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. Затем в каждую пробирку добавляют одинаковое количество взвеси клеток, встряхивают и ставят при комнатной температуре. Результат учитывают по характеру осадка и просветлению надосадочной жидкости. Титром агглютинирующей сыворотки считают её максимальное разведение, при котором наблюдается выраженная реакция. РА используют для идентификации микробов по антигенной структуре, для определения антимикробных антител и их титра в сыворотке при серодиагностике инфекционных заболеваний, при определении группы крови и т.п.

Реакция пассивной /непрямой/ гемагглютинании /РПГА/ является разновидностью непрямых агглютинационных реакций, наряду с реакцией коагглютинации, агглютинации латекса и др. Эти реакции более чувствительны, чем РА, т.к. предварительно стандартный антиген /или антитело/ присоединяют к корпускулярному носителю - эритроцитам, убитым микробам или частицам латекса, получая, соответственно, эритроцитарные, коагглютинирующие или латексные диагностикумы /антигенные или иммуноглобулиновые/. РПГА с антигенным эритроцитарным диагностикумом ставят в пробирках или лунках планшета с двукратными разведёниями сыворотки /например, с целью серодиагностики инфекций или выявления напряжённости иммунитета - по титру антител/. При положительной реакции через 4-20 ч формируется рыхлый осадок эритроцитов на всей площади дна пробирки или лунки При отрицательной реакции эритроциты образуют плотный осадок в центре /в виде пуговицы/. РПГА с иммуноглобулиновыми диагностикумами учитывают так же, но её ставят для быстрой индикаций возбудителя в исследуемом материале или его идентификации по антигенной структуре. Это метод экспресс-диагностики.

Реакция преципитации /РП/- это выпадение в осадок растворимого антигена при взаимодействии с соответствующими антителами-преципитинами в присутствии электролита. Антигеном может быть прозрачный раствор белка или гаптена, различные экстракты. РП ставят несколькими методами. Метод кольцепреципитации: на диагностическую сыворотку с известными преципитинами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают раствор антигена и в течение часа учитывают положительную реакцию /на границе жидкостей образуется белый диск преципитата и постепенно оседает/. Так определяют, например, антиген возбудителя сибирской язвы в разных материалах. Метод преципитации в капилляре: стеклянный капилляр диаметром I мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыворотку, а затем на 1/3 - в раствор антигена, переворачивают несколько раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зёрна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в капилляре. Так определяют, например, С-реактивный белок /СРБ/ при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, туберкулёзе, инфаркте миокарда /диагностическую сыворотку с преципитинами к СРВ получают путем иммунизации кроликов/. Методы диффузной преципитации в агаровом геле; растворы антигенов и антител помещают в разные места прозрачного геля, из которых они диффундируют, образуя при встрече преципитат в виде белых полос или линий. В методе простой диффузии антиген диффундирует в агаре, содержащем определенную концентрацию диагностической сыворотки, которую предварительно вводили в не застывший агар В методе двойной диффузии антигены и антитела из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара.

В методе иммуноэлектрофореза раствор неоднородного антигена сначала подвергают фракционированию в агаровом геле под действием постоянного тока а затем канавку в геле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сывороткой /антителами/. В результате двойной диффузии в геле образуется специфический рисунок из дуг к линий преципитата, вид которого зависит от количества и качества фракций антигена и антител.

РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявлять белковые антигены в разведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступных для обнаружения химическим путём. Титром преципитирующей сыворотки считают наибольшее разведение антигена, дающее преципитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием антигена, малыми размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных антигенов в материале от больных и из внешней среды, определения иммуноглобулинов разных классов /диагностика и профилактика инфекций и иммунодефицитов/ для выявления фальсификации пищевых продуктов /санитарная практика/, для определения видовой принадлежности крови и других биологических примесей /судебно-медицинская практика/.

Реакция нейтрализации токсина антитоксином /РН/ - серологическая реакция между микробным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Её ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для определения титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известной диагностической сывороткой /в избытке/, выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают /как и в контрольной группе животных, получивших тот же материал без сыворотки/. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сывороткой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее определенное число минимальных летальных доз-ДЛМ токсина /это количество соответствует I антитоксической единице, АЕ сыворотки/. Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME /международных антитоксических единиц/ в I мл сыворотки. Например, I ME противодифтерийной сыворотки нейтрализует 100 ДЛМ дифтерийного токсина для морской свинки.

Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках - в реакции флоккуляции /разновидность РП/. Оно основано на том, что при смешивании экзотоксина или анатоксина /т.е. белкового антигена/ с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение /инициальная флоккуляция/ наблюдается в пробирке с эквивалентным соотношением токсина /анатоксина/ и антитоксина / т.е. I TE(Lf) : I AE(ME) /.

Реакция иммунофлюоресценции /ИФ/ - взаимодействие люминесцирующих антител с корпускулярным антигеном и образование светящегося иммунного комплекса. Метод основан на способности иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами /ФИТЦ, акридиновым оранжевым и др./ без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию. В прямом методе ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок из антигенсодержащего материала, наносят на него люминесцирующую сыворотку /например, противочумные антитела, меченные ФИТЦ/. После 30-минутного контакта препарат тщательно промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материале светятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в I фазу и обладает рядом достоинств: высокочувствительна, проста в постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики /ответ в течение 1-2 ч/. Её используют для быстрого обнаружения микробов в исследуемом материале а также для их идентификации.

Иммуноферментный анализ /ИФА/. Основан на использовании антител, меченных ферментом, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИША широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале /сэндвич-метод/ вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистироловой пластины, затем вносят антигенсодержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела /сыворотку/, меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат / 5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др./

При положительной реакции в течение I часа развивается коричневое окрашивание, интенсивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител /например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции/ на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом, и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учитывают так же ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью

16. Реакция агглютинации: что такое агглютинация, что является антигеном, что - антителом; методы постановки, какие контроли ставятся и для чего; как должны выглядеть контроли?

Реакция агглютинации - склеивание бактерий под влиянием спе­цифических антител. Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клет­ки, во второй - образование хлопьев в присутствии электролита (хло­рида натрия). Видимая реакция происходит в том случае, если антите­ла имеют два активных центра, к каждому их них присоединяется анти­ген, и в результате образуется "решетка".

Методы постановки реакции агглютинации:

1) развернутая реакция агглютинации ставится в пробирках с пос­ледовательными разведениями сыворотки;

2) реакция агглютинации на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:5 - 1:10; наступает в течение нескольких минут.

Для определения антигенной структуры микробов, выделенных из организма пациента, используют агглютинирующую сыворотку, полу­ченную из крови животного (кролика, барана), иммунизированного этими микробами. Титром диагностической агглютинирующей сыво­ротки называется наибольшее ее разведение, которое вызывает агг­лютинацию.

Если агглютинирующая сыворотка содержит антитела против Н-антигена, то подвижные бактерии склеиваются своими жгутиками, об­разуются рыхлые хлопья. Это крупнохлопчатая агглютинация, нас­тупающая быстро - в течение двух часов.

Сыворотка, содержащая О-агглютинины, вызывает мелкозернис­тую агглютинацию в течение 18-24 часов.

Агглютинирующие сыворотки, полученные путем иммунизации жи­вотных микробами, могут содержать антитела против родственных микробов, то есть являются поливалентными. Для повышения специ­фичности сывороток из них удаляют групповые антитела методом ад­сорбции по Кастелляни, с помощью групповых антигенов. Получен­ные сыворотки называют адсорбированными. Оставляя антитела толь­ко к одному антигену, получают монорецепторные сыворотки. С таки­ми сыворотками ставят реакцию агглютинации на стекле, которая в этом случае является окончательной, а не ориентировочной.

Для обнаружения антител в сыворотке крови пациента в качестве известного антигена используют убитые культуры микробов, так на­зываемые диагностикумы. При постановке серологического диагно­за учитывают диагностический титр сыворотки - для большинства заболеваний 1:100 или 1:200.

Реакция агглютинации на стекле: необходимые ингредиенты, метод постановки; как выглядит положительная реакция; в чём преимущество реакции по сравнению с развёрнутой реакцией агглютинации и в чём её недостаток; в каком случае реакция агглютинации на стекле является ориентировочной, а в каком случае она даёт окончательный результат?

Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1 : 20) добавляют взвесь бактерии, выделенных от больного животного.

как выглядит положительная реакция;

Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.

в чём преимущество реакции по сравнению с развёрнутой реакцией агглютинации и в чём её недостаток;

1 )ориентировочная РА: - на предметном стекле; - наступающая в течение нескольких минут. - применяется только с целью идентификации вида (серотипа) выделенной из организма больного чистой культуры по его специфичности как АГ к серотипу АТ; 2) развернутая РА: - в пробирках; - учитывается через 2 часа выдерживания при 37 С и на следующий день стояния при комнатной температуре. - применяется с целью идентификации микроба и обнаружения АТ в сыворотке крови.