Этапы приготовления препарата-мазка.

При приготовлении мазка из культуры микроорганизмов, выросшей на поверхности плотной питательной среды, на обезжиренное предметное стекло наносят петлей небольшую каплю физиологического раствора, располагая её в центре круга, нарисованного с обратной стороны карандашом по стеклу. При работе спиртовка должна находиться прямо перед вами, на удобном для работы расстоянии. Предметное стекло должно находиться в чашке Петри или лотке: категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! В правую руку берут бактериологическую петлю, в левую - пробирку с культурой. Петлю стерилизуют, внося её в пламя горелки в вертикальном положении. После того как петля раскалится докрасна, проводят конец петле держателя через пламя. После этого из пробирки вынимают пробку, удерживая её мизинцем правой руки. После обжигания на спиртовке края пробирки в неё вносят петлю, которую охлаждают, прикасаясь к стенкам пробирки. Затем петлей с поверхности среды снимают небольшое количество культуры. Не касаясь стенок пробирки, вынимают петлю и закрывают пробирку пробкой над спиртовкой. После этого пробирку с культурой помещают в штатив, а культуру на петле вносят в приготовленную заранее каплю физиологического раствора, хорошо размешивают и равномерно распределяют по стеклу в виде небольшого круга или овала 1-1,5 см в диаметре. По окончании приготовления мазка петлю вновь стерилизуют в пламени спиртовки. Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло наносят 1-2 петли исследуемого материала, стерилизуя петлю перед каждым погружением в бульонную культуру микроорганизма, как описано выше, и равномерно распределяют по стеклу (в этом случае не требуется предварительного нанесения на стекло физиологического раствора).

Для чего фиксируют мазок?

Цель фиксации: - закрепить мазок на стекле, тем самым предохранить мазок от смывания в процессе окраски.

Способы фиксации мазков.

Для этого используют физический и химический методы. Физический метод заключается в фиксации мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх (троекратно по 1 секунде). Эту операцию проводят достаточно быстро, стараясь не перегреть мазок, так как при перегревании могут произойти изменения морфологии клетки.

Химический метод фиксации является более мягким по сравнению с фиксацией на пламени. В качестве фиксаторов используют этанол, ацетон, смесь Никифорова (эквивалентное соотношение этанола и эфира), метанол, формалин. После фиксации мазок можно окрашивать.

Какие способы окраски называются простыми?

Для простой окраски используют только один краситель, чаще всего красного цвета - фуксин, фиолетового - генцианвиолет (окраска производится в течение 1-2 мин) или синего - метиленовый синий (окраска производится в течение 3-5 мин). 

При окраске простым способом на мазок наносят несколько 12 капель раствора красителя так, чтобы весь мазок был покрыт им. Краситель оставляют на определённое время. Затем препарат промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Какие способы окраски называются сложными, на чём они основаны?

• Окраска по Граму (основной метод окраски в бактериологии) – определение типа строения клеточной стенки • Окраска по Цилю-Нильсену - выявление кислотоустойчивых бактерий (микобактерий) • Окраска по Ожешко - выявление спор • Окраска по Нейссеру – выявление включений волютина и идентификация по их наличию коринебактерий • Окраска по Бурри-Гинсу – выявление капсул

Как производится окраска по Граму в модификации Синёва: в какой цвет окрашиваются грамположительные бактерии, почему?

1. На фиксированный препарат наносят 2-3 капли воды и кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанной краской генцианвиолет. Окрашивают 1-2 минуты.

2. Снимают бумажку, сливают краску и, не промывая водой, наливают на препарат раствор Люголя на 1 минуту.

3. Сливают раствор Люголя и наливают на препарат спирт с йодом на 30 секунд. Промывают водой.

4. После этого окрашивают мазок водным фуксином в течение 1 минуты.

5. Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют. В результате окраски грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. Грамположительные микробы Клеточная стенка содержит толстый слой пептитогликана муреина, который более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

В какой цвет окрашиваются грамотрицательные бактерии, почему?

грамотрицательные - в красный. Тонкий петитогликана муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными - окрашиваются грамотрицательно.

Чем обусловлена способность бактерий различно окрашиваться по Граму?

Наличием тонкого или толстого муреиного слоя.

Какие бактерии (кокки, палочки, извитые) красятся по Граму положительно и какие отрицательно?

+ : Палочки.

-: Кокки, извитые.

Из каких слоёв состоит клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий?

Грамположительные: Наружная мембрана, пептидогликан, внутренняя мембрана.

Г рамотрицательных: пептидогликан, внутренняя мембрана.

Какие бактерии (грамположительные или грамотрицательные) более чувствительны: а) к пенициллину, детергентам, к основным красителям; б) к азидам, окислителям, стрептомицину, переваривающему действию протеаз?

А) грамположительные

Б) грамотрицательны

Грамотрицательные бактерии, в отличие от грамположительных бактерий, в дополнение к клеточной стенке и внутренней мембране имеют еще и внешнюю мембрану, что значительно затрудняет процесс проникновения молекулы антибиотика в бактериальную клетку.

Принцип и техника окраски по Цилю-Нильсену.

1. На фиксированный препарат помещают полоску фильтровальной бумаги, наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на горелке до появления пара, не допуская кипения жидкости. Нагревание повторяют 3 раза.

2. Снимают бумагу, промывают водой.

3. Погружают 3 раза в 5% раствор серной кислоты.

4. Промывают препарат водой и докрашивают метиленовой синью 5 минут.

5. Промывают водой, высушивают препарат фильтровальной бумагой, микроскопируют.

Какие патогенные бактерии являются кислотоустойчивыми?

микроорганизмы, обладающие выраженной резистентностью к 5—10% серной или соляной кислотам, щелочам и спирту. После окрашивания кислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотами с большим трудом, так как содержат жировые и воскоподобные вещества.

 Их устойчивость к перепадам кислотности внешней среды обусловлена особым строением клеточной стенки и составом клеточного содержимого. Окраска таких бактерий карболовым фуксином в красный цвет является очень стойкой – в результате кислотоустойчивые микроорганизмы не обесцвечиваются после обработки их раствором серной кислоты. В данную группу входят различные таксоны – микобактерии, актиномицеты, бактерии, способные к азотфиксации.