Занятие 30 микробиологическая диагностика чумы, туляремии, бруцеллёза, сибирской язвы (окончание). Микробиологическая диагностика спирохетозов Контрольные вопросы
Возбудитель сибирской язвы: название по-латыни, морфология, расположение, споры, жгутики, капсула, окраска по Граму. Какими способами можно простерилизовать материал, заражённый сибиреязвенной палочкой?
Род – Bacillus
Вид – Bacillus anthracis (от греч. аnthrax – уголек)
Морфология.
Очень крупные палочки с обрубленными концами размером 5-10×1-2 мкм; жгутики отсутствуют; в организме человека и животных, а также на питательных средах с кровью образуют макрокапсулу белковой природы; в присутствии О2 формируют центрально расположенные овальной формы споры; грамположительные; в мазках располагаются цепочками с утолщениями на концах (напоминают «бамбуковую трость»); обработка культур пенициллином приводит к разрушению клеточной стенки и образованию цепочек, состоящих из протопластов (в виде «жемчужного ожерелья»); споры окрашиваются по методу Ожешко в красный цвет; капсула выявляется по методу Бури-Гинса и Романовского-Гимзе.
Вегетативные формы чувствительны к факторам внешней среды - при 60°С погибают в течение 15 минут. В почве, куда возбудитель попадает с испражнениями, мочой больных животных или трупами, сибиреязвенные палочки образуют споры. Они высокорезистентны: в почве остаются живыми в течение многих лет, выдерживают кипячение в течение 20 минут. Убить их можно сухим жаром или автоклавированием в режиме стерилизации.
На каких средах культивируется, характер роста на плотной среде и в жидкой среде, отношение к желатину?
Факультативный анаэроб, оптимальная температура культивирования 35-37 С, рН 7,2-7,6, хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ). Через 17-24 часа образует R-форму колоний – серебристые крупные зернистые колонии, от краев отходят пучки нитей (в виде «головы Медузы» или «львиной гривы»), редко – S- и М-формы. На бульоне растет в виде ватных хлопьев, не вызывая помутнения среды. Дает характерный рост при посеве уколом в желатин – в виде «перевернутой елочки». На кровяном агаре гемолиза не дает.
Какие антигены содержит, какой из антигенов участвует в реакции Асколи; факторы вирулентности.
1.О-антиген – соматический, термостабильный липополисахарид клеточной стенки, группоспецефический (выявляется в реакции колцепреципитации по Асколи).
2. К-атиген – капсульный, полипептидный, видоспецифический.
3. Протективный антиген – белковый токсин – обладает выраженными иммуногенными свойствами, т.к. к нему образуются антитела, обладающие защитными свойствами.
Факторы патогенности.
Токсины. Bacillus anthracis выделяет экзотоксин, имеющий сложную структуру – состоит из трех компонентов: протективного антигена, летального и отечного факторов.
Протективный антиген – взаимодействует с мембранами клеток и опосредует проявление активности других компонентов. Летальный фактор («мышиный токсин») – проявляет цитотоксический эффект и вызывает отек легких. Отечный фактор – повышает концентрацию цАМФ, вызывая развитие отеков. Эти компоненты по отдельности токсическое действие не проявляют! Синтез экзотоксина контролируется плазмидой.
Ферменты – протеазы, обеспечивающие инвазию и приводящие к деструкции тканей.
Структурные и химические компоненты клетки: капсула (участвует в адгезии и защищает от фагоцитов), споры (обеспечивают длительное сохранение во внешней среде).
Сибирская язва у человека: название по-латыни, источник инфекции, пути проникновения возбудителя в организм, перечислите клинические формы, наблюдается ли бактериемия.
Типичный зооноз. Среди животных наиболее восприимчивы травоядные (КРС, лошади, свиньи). Животные заражаются при заглатывании спор во время выпаса или при поедании загрязненных кормов.
Источник инфекции – больные животные (выделяют возбудителя сибирской язвы с мочой и испражнениями). Значительную эпидемиологическую опасность представляют скотомогильники, особенно если трупы животных, павших от сибирской язвы были зарыты без надлежащих предосторожностей.
Пути передачи:
Прямой контактный (при контакте с инфицированным материалом – уходе за больными животными, убое, разделке туш);
Алиментарный (при употреблении в пищу мяса больных животных);
Воздушно-капельный, воздушно-пылевой (при вдыхании спор возбудителя);
Возможен трансмиссивный путь (через укусы кровососущих насекомых – слепней и мух).
Инкубационный период – 2-3 суток.
Патогенез и клинические особенности.
В зависимости от места входных ворот выделяют:
*Кожная форма (чаще) – во входных воротах сначала больные отмечают усиливающийся кожный зуд, затем появляется красноватое пятно, быстро трансформирующееся в папулу медно-красного цвета, через несколько часов на месте папулы образуется везикула с серозно-геморрагическим содержимым, из-за сильного зуда больные часто срывают везикулу, либо она лопается сама, и на ее месте образуется черный увеличивающийся в размерах струп (напоминает уголек), струп окружен инфильтратом в виде багрового вала. Кожная форма сопровождается повышением температуры тела до 39-40С, длится примерно 5-6 дней, летальность не более 5%.
*Легочная форма – протекает очень тяжело, развивается пневмония по типу отека легких, в большинстве случаев заканчивается летально (смерть наступает на 2-3 сутки вследствие сердечно-сосудистой недостаточности).
*Кишечная форма – проявляется повышением температуры до 39-40С, рвотой и диареей с кровью, заканчивается летально в 100% случаев.
При всех формах возможно развитие диссеминированной инфекции.
Микробиологический диагноз сибирской язвы; перечислите методы исследования, материалы для исследования. Что можно видеть при микроскопии мазка из исследуемого материала, какое значение имеет микроскопический метод? Выделение чистой культуры: ход исследования и результаты, отличие сибиреязвенных бацилл от непатогенных бацилл, какая диагностическая проба ставится на больном?
Материал: отделяемое карбункула или язвы, испражнения, моча, мокрота, кровь.
Микроскопический метод. Мазки из исследуемого материала окрашивают по Граму, Романовскому-Гимзе, Ребитеру (капсула), а также люминесцирующей сибиреязвенной сывороткой. Обнаружение в препаратах окруженных капсулой крупных грамположительных бацилл в виде цепочек дает возможность поставить предварительный диагноз сибирской язвы. В качестве экспресс-метода диагностики применяется РИФ, с помощью которой выявляют характерные сибиреязвенные бациллы в виде палочек со светящимся желто-зеленым ободком.
Бактериологический метод.
1 день. Посев на кровяной МПА или PLET-агар. Культивирование посевов при 370 С.
2 день Учет характера роста (шероховатые колонии в виде «головы медузы»). Микроскопческое исследование типичной колонии, ее пересев на скошенный МПА для выделения чистой культуры.
3 день. Проверка чистоты выделенной культу-ры, пересев на среды «пестрого» ряда для определения ферментативных свойств; постановка проб на фаголизабельность и чувствительность к антибиотикам. Биопроба.
4 день. Заключение о виде выделенной культуры на основании ее идентификации по морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам и фаголизабельности. Микроскопическое и бактериологическое исследование трупа животного, павшего в результате биопробы .
Бактериологический метод - посев исследуемого материала на МПА, кровяной агар в чашках Петри или PLET-arap с полимиксином В, лизоцимом, этилендиаминотетраацетатом (ЭД-ТА) и ацетатом таллия. Контаминированный материал из внешней среды, от животных, из старых трупов предварительно прогревают при 63 °С в течение 15 мин с целью уничтожения вегетативных форм микроорганизмов. Посевы помещают в термостат на сутки. Через 20 —24 ч инкубации посевов при 37 С на МПА обнаруживают характерные шероховатые колонии в виде «головы медузы», края которых при малом увеличении микроскопа имеют вид вьющихся локонов или «львиной гривы» - рис. 12. В бульоне характерен придонный рост, напоминающий комочек ваты, при этом среда остается прозрачной. Из осадка делают мазок и препарат висячей капли. В мазке обнаруживают бескапсульные грамположительные стрептобациллы (расположение в виде длинных цепочек в виде «бамбуковой палки»). В отличие от других почвенных бацилл возбудитель сибирской язвы неподвижен. Для выделения чистой культуры типичные колонии пересевают на скошенный МПА.
Капсулообразование можно выявить путем биопробы или при посевах в бульон Хоттингера, на специальную среду, содержащую раствор Хенкса и 40 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота, МПА с 0,7 % бикарбоната натрия, среду Буза (3% голодный агар с 15% дефибринированной крови барана), а также в дефибринированную лошадиную кровь. Посевы выращивают в течение 18-24 часов при температуре 37 С в атмосфере 5-7% СО2.
Идентификацию выделенной культуры Bacillus anthracis (3-й день исследования) и ее дифференциацию от сходных непатогенных бацилл проводят путем посева уколом в желатину (разжижение в виде елочки, перевернутой вершиной вниз), изучения биохимических свойств, фаголизабельности и заражения животных. Определяют также чувствительность культуры к антибиотикам.
Одним из характерных признаков возбудителя сибирской язвы является тест «жемчужного ожерелья». На поверхность МПА в чашке Петри с 0,5 и 0,05 ЕД/мл пенициллина засевают 3-часовую бульонную культуру выделенного микроорганизма, через 3 ч инкубирования при 370 С готовят мазки, в которых при микроскопии находят «жемчужные ожерелья» в виде округлившихся стрептобацилл сибирской язвы. Почвенные бациллы сохраняют форму палочек, расположенных цепочками.
Биопроба
Исследуемым материалом подкожно заражают двух белых мышей, которые погибают через 24-48 ч после заражения. В мазках из внутренних органов и крови обнаруживают типичные капсульные бациллы. Проводится бактериологическое исследование трупа белой мыши с целью выделения чистой культуры сибиреязвенных бацилл.
Аллергический метод – постановка внутрикожной аллергической пробы с аллергеном сиби-реязвенной бациллы - антраксином. Результаты учитывают через 24 ч. Пробу считают положитель-ной при наличии гиперемии и инфильтрата диаметром более 15 мм.
Реакция Асколи: что это за реакция, что обнаруживают с помощью этой реакции, что служит исследуемым материалом; что является диагностическим препаратом, что он содержит, техника постановки.
Наличие сибиреязвенного антигена в разложившемся трупе животного, коже (свежей, сухой, выделанной) и изделиях из нее, шкурках, мехе, шерсти определяют с помощью реакции термопреципитации по Асколи. Исследуемый материал измельчают, заливают 10 —20-кратным объемом физиологического раствора, кипятят в течение 10-45 мин., после чего фильтруют. Полученный экстракт осторожно наслаивают на преципитирующую сибиреязвенную сыворотку в узкой преципитационной пробирке. На границе экстракта и преципитирующей сыворотки в течение 1- 5 мин в случае положительной реакции появляется кольцо белого цвета (преципитат). Контроли включают постановку реакций с заведомо положительной и отрицательной сывороткой, нормальной сывороткой и т.д.
Препараты для специфической профилактики и терапии чумы, туляремии, бруцеллёза; работы отечественных учёных.
Чума. Постинфекционный иммунитет – в основном, клеточный, напряженный, пожизненный. Специфическая профилактика осуществляется живой вакциной из штамма EV. После вакцинации развивается иммунитет продолжительностью до 6 месяцев. Вакцина вводится однократно накожно или подкожно: помощью безыгольного инъектора; разработана таблетированная живая вакцина штамма EV для перорального применена (А. А. Воробьев, Е. М. Земсков), а также аэрозольная вакцина (В. А. Лебединский и соавт.). Проводится вакцинация по эпидпоказаниям, а также планово – группам риска (в основном, военнослужащим) Специфическое лечение – противочумной иммуноглобулин.
Бруцеллез. Для специфической профилактики применяют живую бруцеллезную вакцину, предложенную П. А. Вершиловой, из штамма ВА-19А, полученную из В. abortus и создающую перекрестный иммунитет против других видов бруцелл. Вакцинацию проводят по эпидпоказаниям. Специфическое лечение – противобруцеллезный иммуноглобулин, для лечения хронических форм заболевания применяется убитая бруцеллезная вакцина.
Туляремия. Для специфической профилактики применяют живую туляремийную вакцину, полученную отечественными учеными Б. Я. Эльбертом и Н. А. Гайским из штамма № 15. Вакцина обеспечивает прочный иммунитет при заражении европейским и голарктическим подвидами и эффективна против американской разновидности возбудителя. Вакцинацию проводят по эпидемическим показаниям, а также лицам, относящимся к группам риска. Специфическое лечение – не разработано.
Общая характеристика спирохет. Классификация спирохет: перечислите (по-латыни) названия родов, видов спирохет и заболевания, которые они вызывают.
Спирохетозы – это группа инфекционных заболеваний, вызываемых спиралевидными бактериями, характеризующиеся общей интоксикацией и цикличностью развития.
Таксономия.
Порядок – Spirochaetales (от греч. speira – завиток, chaite – волос)
Семейство – Spirochaetaceae Leptospiraceae
Род – (три рода патогенных спирохет) Treponema Borrelia Leptospira
Spirochaeta
Cristispira
Brachyspira
Leptonema
Serpulina
Морфология.
Длинные, тонкие, спирально-изогнутые микроорганизмы, размеры 0,1-0,3х5-250 мкм. Центральной структурой является протоплазматический цилиндр, в котором содержатся цитоплазма, нуклеоид, рибосомы и ферменты, окруженный цитоплазматической мембраной. Протоплазматический цилиндр имеет постоянную спиралевидную форму, благодаря пептидогликану, образуя первичные завитки. Их число, тип, шаг, угол наклона варьируют у разных видов. В результате изгиба всего тела образуются вторичные завитки. Вокруг спиралевидного протоплазматического цилиндра располагаются периплазматические жгутики (эндожгутики), один конец их прикреплен к одному из полюсов протоплазматического цилиндра, а другой – к последнему примерно посередине клетки, количество жгутиков от 2 до 100 (одна половина прикреплена к одному полюсу, а вторая – к другому). Периплазматические жгутики спирально обвивают протоплазматический цилиндр, образуя осевую нить, поверх которой располагается многослойная наружная клеточная оболочка спирохеты, т.е. жгутик расположен между ней и цилиндром (поэтому и называется эндожгутиком). C помощью жгутиков спирохеты активно передвигаются (жгутики сокращаются вокруг своей оси, совершая поступательные и сгибательные движения). Спор и капсул не образуют. При неблагоприятных условиях образуют цисты (сворачиваются в клубок, выделяя слизь и покрываясь муциновой оболочкой), могут превращаться в L-формы.
Тинкториальные свойства.
Грамотрицательные, но плохо окрашиваются анилиновыми красителями (кроме боррелий), применяют метод окраски по Романовскому-Гимзе и серебрение по Морозову.
Роль в патологии.
Трепонемы являются возбудителями сифилиса (Т. pallidum), фрамбезии (тропическая гранулёма, невенерический сифилис) (T. pertenue), эндемического сифилиса – беджеля филис (беджель, невенерический сифилис детского возраста) (T. endemicum=bejel), пинты (T. carateum).
Лептоспиры – лептоспироза.
Боррелии – эпидемического вшивого (B. recurrentis) и эндемического клещевого (B. caucasica, persica, duttonii, hispanica и т.д.) возвратного тифов, лайм-боррелиоза (B. burgdorferi, garinii и afzelii).
Возбудители лептоспирозов: название по-латыни рода и вида патогенных лептоспир, варианты лептоспир, циркулирующих в нашей стране; морфология лептоспир, характер движения, отношение к окраске, среды для культивирования, температурный оптимум роста.
Возбудитель лептоспироза - Leptospira interrogans.
Морфология. Тонкие извитые нити, размеры 6-20х0,1 мкм; с 20-40 мелкими первичными завитками, первичные завитки тесно сжаты, при обычном увеличении не различимы (видны в электронном микроскопе), это придает им в мазке вид «четок» или «нитей жемчуга»; имеют вторичные завитки на концах, придающие им S- или С-образную форму в зависимости от направления загнутых концов; спор, капсул не имеют; с обоих концов отходят по два периплазматических жгутика, очень подвижны. Цист не образуют.
Тинкториальные свойства.
Плохо окрашиваются анилиновыми красителями, грамотрицательные, по Романовскому-Гимзе окрашиваются в розовый цвет, при импрегнации серебром по Морозову – коричневые или черные, изучаются с помощью фазово-контрастной микроскопии.
Культуральные свойства.
Аэробы или микроаэрофилы, оптимальная температура культивирования 28-30 С, рН 7,2-7,4, длительность – 3-7 дней. Не растут на простых питательных средах (в природе живут в воде), но требуют повышенной влажности сред (гидрофилы). Для культивирования используют жидкие, полужидкие и плотные среды с добавлением кроличьей сыворотки (например, водно-сывороточная среда Уленгута, фосфатно-сывороточная среда). На плотных и полужидких питательных средах растут в нескольких миллиметрах от поверхности в виде бесцветных плоских дисков. При росте в жидких питательных средах визуального изменения не вызывает (о результатах роста судят по данным микроскопии в темном поле).
Биохимические свойства: малоактивны (каталазо-, оксидазо+).
Антигенная структура.
Сложная, по химическому составу выделяют полисахаридные, липидные, белковые антигены
(антигенную структуру изучают в РМАЛ). Известны более 200 сероваров, объединенных в 25
серогрупп (более 100 сероваров патогенны для человека). В Кировской области встречаются
серовары: L.рomona, L.grippotyphosa, L.iсterohaemorrhagia.
Факторы патогенности.
Изучены недостаточно.
Токсины. Обнаружены эндотоксино-и экзотоксиноподобные вещества:
Эндотоксин – вызывает общую интоксикацию, кровоизлияние за счет повышения
проницаемости сосудов.
Токсическое вещество белковой природы – обладает цитотоксическим действием.
Гемолизин обусловливает гемоглобинурию, желтуху, анемию.
Ферменты патогенности: фибринолизин, плазмокоагулаза.
Структурные и химические компоненты клетки: адгезины, высокая подвижность за счет
жгутиков.
Источники и пути заражения человека.
Источник инфекции и основной резервуар лептоспир в природе – различные виды мелких млекопитающих насекомоядные, особенно грызуны, сельскохозяйственные и домашние животные и водоплавующие птицы (хронические носители лептоспир, выделяют с мочой). У грызунов и насекомоядных лептоспирозная инфекция протекает бессимптомно, сопровождаясь выделением лептоспир с мочой. Лептоспирозы у сельскохозяйственных животных протекают остро, подостро или в форме хронического бессимптомного лептоспироносительства.
Механизм передачи инфекции:
Урино-оральный (пути – водный – при употреблении для питья, контактный – при купании, уходе за больными животными, забое, разделке туш и алиментарный – чаще мясо и молоко).
Заражение человека происходит при купании и использовании воды из открытых водоемов, зараженных мочой больных животных, при контакте с инфицированным сырьем, употреблении зараженных лептоспирами продуктов. Инфекция передаётся человеку посредством прямого контакта с мочой инфицированных животных или через объекты внешней среды, контаминированные мочой животных-лептоспироносителей (главным образом, через воду, почву и растения, иногда пищевые продукты).
Больной человек является «тупиком» для возбудителя инфекции и не имеет практического значения как его источник.
Носит профессиональный характер.
К группам профессионального риска заболевания лептоспирозом относятся:
работники животноводческих хозяйств, мясокомбинатов, боен,утильзаводов, канализационной сети;
работники порто/в;
работники складских помещений;
шахтёры
сельскохозяйственные рабочие, занятые на покосах, жатве,возделывании риса;
работники культурных и спортивных учреждений, работающие с животными (цирки, конно-спортивные и другие)
персонал лабораторий, работающих с патогенными лептоспирами;
работники различных организаций, работающие с мелкими млекопитающими в полевых условиях.
Сезонность – весенне-летняя (покосные вспышки).
Входные ворота: поврежденная кожа (достаточно экскориации), неповрежденные слизистые (ЖКТ, глаз, мочеполовых органов).
Патогенез и клинические особенности.
В патогенезе (по К.Н.Токаревичу, 1982 г.) различают 5 фаз:
I фаза (7-20 дней) – инкубационная, внедрение возбудителя в организм, благодаря активному движению быстрое проникновение в лимфоузлы и кровь – первичная бессимптомная бактериемия и диссеминация возбудителя.
II фаза (1 неделя заболевания) – вторичная бактериемия, проникновение в органы и ткани (в
основном паренхиматозные – печень, почки, легкие, оболочки мозга и т.д.), где возникают
воспалительные и дегенеративные изменения. Клинически – резкое повышении температуры (38-
400С), лихорадка, сильная головная боль, мышечная боль (особенно в икроножных мышцах).
III фаза (2 неделя заболевания) – токсическая (максимальное развитие токсемии). Поражение
продуктами метаболизма лептоспир капилляров – капилляротоксикоз. Развиваютя:
Геморрагического синдрома (гемморагии на коже, слизистых, внутренних органах).
Желтуха (обусловлена гемолизом и некротическими изменениями печеночной паренхимы).
Нарушение мочеобразования и мочевыделения (повреждается эпителий почечных канальцев,
коркового и подкоркового вещества).
Менингит (накопление лептосир в СМЖ).