Основные методы исследования морфологии бактерий. Микроскопия. Простые и сложные методы окраски бактерий. Метод Грама.
Ответ.
Микроскопия:
Световая – осуществляется с помощью обычного светового микроскопа. Изображение создается за счет различий в степени поглощения света разными участками изучаемого окрашенного объекта. При прохождении луча через окрашенный объект происходит изменение интенсивности света, то есть изменяется амплитуда световой волны.
Иммерсионная – объектив погружают в каплю имерсионной жидкости. Масло имеет такой же коэффициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее рассеивание световых лучей.
Темнопольная – лучи освещают объект сбоку и не попадают в глаз наблюдателя, поле зрения остается темным, а объект светящимся. В основе темнопольной микроскопии лежит эффект Тиндаля – рассеивание света при прохождении светового пучка через оптически неоднородную среду.
Фазово-контрастная дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной.
Люминесцентная – основана на способности веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой длиной волны. При люминесцентной микроскопии используют как естественную (первичную, собственную) люминесценцию микробов, так и искусственную (вторичную, наведенную) люминесценцию.
Электронная – для ее осуществления необходим электронный микроскоп, принцип его действия заключается в том, что вместо световой волны используется пучок электронов, что позволяет увеличить чувствительность метода на несколько порядков, ЭМ используется для обнаружения и изучения вирусов, а также для изучения ультраструктуры бактериальной клетки.
Простые методы окраски. Проводятся в один этап и заключаются в окраске микропрепарата одним красителем. Используют основные анилиновые красители, такие как, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде водных растворов или пропитанных красителем фильтровальных бумажек, которые помещают на мазок и смачивают водой. Продолжительность окраски составляет 3-5 минут, после чего микропрепарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. В препаратах, окрашенных простым методом, можно получить представление о форме, расположении и размерах микробных клеток.
Сложные методы окраски. Сложные (дифференцирующие) методы окраски (по Граму, Цилю-Нельсону и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и дополнительных способов обработки препаратов. Эти методы позволяют дифференцировать бактерии в зависимости от строения их структур, чаще всего поверхностных. Например, метод окраски по Граму позволяет дифференцировать бактерии по строению их клеточной стенки: грамположительные (фиолетовые) с толстой и грамотрицательные (красные) бактерии с тонкой КС.
Существуют специальные сложные методы окраски, которые используют для выявления структурных компонентов бактериальной клетки: капсул, цитоплазматических включений, спор, жгутиков.
Метод Грама. Относится к сложным методам окраски и позволяет дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, что является важным таксономическим признаком. Результат окраски определяется особенностями строения клеточной стенки бактерий.
При окраске генцианвиолетом и последующем воздействии раствора Люголя образуется комплексное соединение генцианвиолета и йода с пептидогликаном, которое при дифференциации спиртом (спирт к тому же сужает поры КС Г+!) удерживается в клетках грамположительных бактерий, имеющий многослойный пептидогликан и вымывается из грамотрицательных бактерий, имеющих тонкий слой пептидогликана. При дополнительной окраске водным раствором фуксина грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.
Методика окрашивания препаратов по методу Грама:
1. На фиксированный препарат наносят несколько капель раствора генцианового фиолетового или помещают полоску фильтровальной бумаги, на которую наливают раствор красителя. Краситель выдерживают в течение 1-2 минут, после чего избыток красителя сливают или снимают фильтровальную бумагу.
2. Не промывая препарата, наносят несколько капель раствора Люголя и выдерживают в течение 1-2 минут до почернения препарата. Избыток красителя сливают.
3. На препарат наносят несколько капель этилового спирта (96%) и выдерживают в течение 30 секунд. После этого спирт сливают, препарат промывают водой, избыток воды сливают.
4. На препарат наносят несколько капель раствора фуксина и выдерживают в течение 1-2 минут. Избыток красителя смывают водой.
5. Препарат высушивают фильтровальной бумагой и досушивают на воздухе.
-
краситель
время
результат
Генцианвиолет
2 мин
Палочки и кокки – синий
Раствор Люголя
1 мин
Палочки и кокки – синий
Спирт 95%
15 сек
Палочки – обесцечиваются,
кокки – синий
Промывание водой
Фуксин Пфейфера
3 мин
Палочки – красные, кокки – синие
Промывание водой и сушка