5. Молекулярно-биологический метод

Одним из самых современных методов молекулярной биологии является метод ПЦР – полимеразная цепная реакция. Исследование методом ПЦР имеет ряд преимуществ, так как данный метод позволяет увеличивать (амплифицировать) в сотни раз участок ДНК возбудителя заболевания в исследуемом образце.

Метод ПЦР имеет высокую чувствительность и абсолютную специфичность. С помощью молекулярно-генетического исследования, в частности, ПЦР, можно выявить в любом субстрате даже следы генетического материала микробного или вирусного происхождения.

Метод основан на принципе естественной репликации ДНК. Он включает расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное их дополнение. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Промаркировав такими блоками специфический только для данного вида (но не для других видов) участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок и выявить его в реакции иммуноэлектрофореза.

6. Экспресс-диагностика инфекции

Методы иммунологической экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффективного решения проблем инсектологии и осуществления всех соответствующих противоэпидемических мероприятий.

Основные объективные требования к экспрессным методам идентификации микроорганизмов:

1) получение результатов анализа в максимально короткие сроки;

2) проведение и завершение анализа без выделения микроорганизма в чистой культуре при использовании только нативного материала, в крайнем случае с привлечением элективных сред для быстрого накопления возбудителей;

3) высокая специфичность и высокая чувствительность;

4) высокая степень производительности, простота, доступность и воспроизводимость анализов.

Какому из существующих методов экспресс-диагностики отдать предпочтение, зависит от многих конкретных условий. Однако наиболее оптимальным является использование 2-3 методов. Этот подход увеличивает надежность получаемого результата.

Направления использования ЭД.

1. Энзимоиндикационное направление – метод, связанный с экспресс-индикацией биохимических свойств микроорганизмов и определением их ферментативного спектра.

Сущность энзимоиндикационных методов состоит в том, что субстрат с индикатором отделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. Имеются углеводно-бумажные диски с защитной пленкой (бумажные реагенты для определения дезаминаз у микробов) и их аналоги бумажно-индикаторные системы, углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки. Они позволяют в течение кратчайшего срока (3-5 ч) определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов.

2. Иммунофизическое направление – направление, использующее различные по природе и величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенов и антител. Это способствует повышению чувствительности комплексных иммунологических методов.

Реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) связаны с использованием эритроцитарных диагностических препаратов. Эритроцитарную диагностику применяют для ускоренного обнаружения и идентификации микроорганизмов (например, возбудителей туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.) в различных биологических материалах и в объектах внешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами весьма чувствительны и часто превосходят иные серологические реакции.

3. Иммунохимическое направление использует разнообразные комплексные соединения специфических антител или антигенов с химическими веществами. Химические вещества придают антигенам и антителам новые феноменологические способности и свойства, тем самым расширяя возможности экспресс-индикации микробных агентов в частности и лабораторного анализа вообще.

Практическую значимость приобрели методы иммунофлуоресцентного анализа (прямой, непрямой), которые ныне официально используются как методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов.

4. Иммуноферментное направление интенсивно развивается в последние годы: разработаны прямой, непрямой, антикомплементарный и другие методы быстрого обнаружения микробов путем использования иммуноэнзимологического принципа. Разработчиками предложены новые виды ферментов, а также разнообразные виды хромогенных субстратов.

5. Микроцитологическое направление цитоморфологического анализа связано с использованием светлопольной, фазово-контрастной или люминесцентной микроскопии бактериологических мазковых препаратов, обработанных и окрашенных красителями, позволяющими быстро идентифицировать микроорганизмы по их морфологии и специфическим структурным элементам микробной клетки.

6. Фагодиагностическое направление предусматривает идентификацию микробов в различных объектах с помощью специфических индикаторных бактериофагов, обнаружение и индикацию специфических фагов в различных материалах с помощью индикаторных микробных культур, позволяет значительно сократить сроки исследований и установить природу возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами ввиду его изменчивости или загрязненности материала он остается нераспознанным.

7. Биологическое направление связанно с изучением токсических и агрессивных свойств микроорганизмов. Методы реализуют на одноклеточных организмах, культурах клеток, куриных эмбрионах, на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторных животных. Эти методы менее точны по сравнению с другими.

8. Физико-химическое направление связано с использованием быстрых и достаточно сложных по аппаратурному оформлению методов. Методы включают изучение бактериальных популяций и их экстрактов с помощью хроматографии (газожидкостная и др.), спектроскопии (инфракрасной, ультрафиолетовой и др.), резистографии, позволяющих установить различные антибиотические, химические и лекарственные вещества, а также температурной и кислотной агрегации, коагуляции микробных суспензий и их токсинов.