17. Биологические особенности вирусов. Морфология, ультраструктура, механизм репродукции. Основы классификации. Методы культивирования вирусов.

Ответ.

Биологические особенности вирусов.

1. Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие – от 20 до 40 нм. 1 мм=1000 мкм, 1 мкм=1000 нм.

2. Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа – или ДНК (ДНК- вирусы) или РНК (РНК- вирусы). У всех остальных организмов геном представлен ДНК, в них содержится как ДНК, так и РНК.

3. Простое строение вируса.

4. Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

5. Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты дизъюнктивно.

6. У вирусов нет собственных систем мобилизации энергии и белок-синтензирующих систем, в связи с чем вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

7. Средой обитания вирусов являются живые клетки – бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека.

Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной – вирион и внутриклеточной – вирус. Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов – конечной фазы развития вирусов.

Морфология и УС вирусов.

По своей структуре вирусы представляют собой геометрически правильные образования, состоящие из центральной части (генома) и одной или двух оболочек.

1. Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК-вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК-вирусов).

2. Капсид – белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц – капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид-спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы).

При спиральной симметрии белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота (нитевидные вирусы). При кубическом типе симметрии вирионы могут быть в виде многогранников, чаще всего – двадцатигранники – икосаэдры.

3. Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид, т.е. комплекс генома с капсидом и называются “голыми”.

4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина – суперкапсид (пеплос). Такие вирусы называют “одетыми”. Суперкапсидная оболочка вируса является модифицированной цитоплазматической мембраной клетки, в которой репродуцировался данный вирус.

5. На поверхности некоторых оболочечных вирусов располагаются шипы или шипики (пепломеры, суперкапсидные белки) – это липопротеиновые или гликопротеиновые выступы. Шипы выполняют функцию взаимодействия вирусных частиц с чувствительными клетками.

6. У некоторых сложных вирусов между суперкапсидом и капсидом расположен слой белка, который называется матриксом (мембранный, матриксный белок, М-белок, внутренняя белковая мембрана). Этот белок способствует взаимодействию суперкапсида с нуклеокапсидом

Репродукция вирусов.

Существуют некоторые общие закономерности репродукции вирусов:

1. Все РНК-содержащие вирусы, кроме вирусов гриппа и ретровирусов, репродуцируются в цитоплазме клетки. Геномы вирусов гриппа и ретровирусов при репродукции проникают в ядро инфицированной клетки.

2. Репродукция всех ДНК-содержащих вирусов, кроме вирусов оспы, протекает как в ядре, так и в цитоплазме клетки. При этом в ядре происходит транскрипция и репликация вирусных нуклеиновых кислот, а в цитоплазме клетки – трансляция вирусных белков и сборка дочерних вирионов. Размножение вирусов оспы происходит полностью в цитоплазме клетки.

3. Нуклеокапсидные белки вирусов синтезируются на свободных полирибосомах (не связанных с мембраной), а суперкапсидные белки – на рибосомах, ассоциированных с мембранами.

4. Белки некоторых вирусов после образования подвергаются протеолитическому процессингу (расщеплению или разрезанию).

5. Суперкапсидные белки оболочечных вирусов при транспортировке к клеточной мембране подвергаются гликозилированию.

Механизм репродукции:

1. источником мономеров для синтеза нуклеиновых кислот служат нуклеотиды клетки;

2. источником мономеров для синтеза вирусных белков служат аминокислоты (аминоацил тРНК) клетки;

3. синтез белков всех вирусов осуществляется на клеточных рибосомах;

4. источник энергии для биосинтетических процессов при репродукции всех вирусов — аденазинтрифосфорная кислота (АТФ), вырабатываемая в митохондриях клетки;

5. дизъюнктивный (разобщенный во времени и в пространстве) биосинтез структурных компонентов вирусов. Так, нуклеиновая кислота вируса может реплицироваться, например, в ядре клетки, вирусный белок синтезируется в цитоплазме, а сборка цельных вирионов или нуклеокапсидов может происходить на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Наконец, сложный липопротеиновый суперкапсид может приобретаться вирусами в процессе почкования;

6. репликацию нуклеиновых кислот вирусов осуществляют ферменты – полимеразы (ДНК-полимеразы и РНК-синтетазы), которые могут быть клеточными полимеразами, присутствующими в клетке до ее заражения вирусом, либо вирусспецифическими, появляющимися после заражения клетки вирусом, так как биосинтез их закодирован в структуре нуклеиновых кислот самих вирусов или они находятся в вирионе вируса;

7. точность копирования молекул нуклеиновых кислот при их репликации обеспечивается матричным механизмом и принципом комплементарности.

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.

1. Адсорбция – пусковой механизм, связанный со взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (прикрепительные белки, у вируса гриппа – гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека – гликопротеин gp 120) и наличием разноимённых зарядов вируса и клетки-хозяина.

2. Проникновение – путем слияния суперкапсида с мембраной клетки (белки слияния, характерно для сложных вирусов) или путем эндоцитоза (пиноцитоза, характерно для простых вирусов).

3. Освобождение нуклеиновых кислот – “раздевание”, депротеинизация, нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты за счёт протеаз и липаз. Фаза эклипса – не вирион.

4. Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков (дизъюнктивный способ репродукции), т.е. подчинение систем клетки-хозяина и их работа на воспроизводство вируса.

• У ДНК-содержащих вирусов проникший в цитоплазму нуклеокапсид транспортируется к ядру клетки. Вирусная ДНК проникает в клеточное ядро, где протекает транскрипция – переписывание информации с ДНК на РНК с помощью клеточной полимеразы. Исключение составляет ДНК-содержащий вирус оспы, у которого транскрипция протекает в цитоплазме клетки при участии вирусспецифического фермента (ДНК-полимеразы), который проникает в клетку в составе вириона. В результате транскрипции на матрице одной из нитей ДНК синтезируется иРНК, которая перемещается в цитоплазму клетки и запускает процесс трансляции – перевода генетической информации с иРНК на последовательность аминокислот в вирусных белках. Синтез белков происходит на рибосомах клетки. Одновременно в ядре клетки протекает процесс репликации (образование дочерних нуклеиновых кислот на матрице материнской ДНК).

• Репликация плюс-РНК вирусов происходит в цитоплазме клеток. При этом функции иРНК выполняет вирусная нуклеиновая кислота. В результате трансляции на рибосомах образуется белковая молекула, которая разрезается клеточными протеазами на структурные и неструктурные вирусные белки. При этом образуется также полимераза, которая способствует образованию минус-РНК на матрице родительской плюс-РНК. На матрице минус-РНК происходит синтез молекул плюс-РНК, участвующих в биосинтезе белков дочерних вирионов.

• Минус-РНК вирусы. В цитоплазме клетки на матрице минус-РНК вначале синтезируется плюс-РНК. Этот процесс катализируется полимеразой (транскриптазой), находящейся в составе проникшего в клетку вириона. При синтезе плюс-РНК образуются полные нити и короткие нити. Короткие плюс-РНК-нити участвуют в синтезе ферментов и белков для дочерних популяций. Полные нити плюс-РНК служат матрицей для синтеза молекул минус-РНК дочерних вирионов.

• РНК-содержащие ретровирусы имеют уникальный путь репродукции. После проникновения в клетку генетическая информация с РНК этих вирусов переписывается на ДНК. Этот процесс называется обратной транскрипцией. Для его осуществления требуется специфический фермент - обратная транскриптаза или ревертаза. Затем вновь образованная ДНК интегрирует с клеточным геномом и в его составе участвует в образовании иРНК, необходимой для синтеза вирусных белков. Транскрипцию интегрированной ДНК в составе клеточных геномов (переписывание информации с ДНК на иРНК) осуществляет клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза.

5. Сборка вирионов – ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с наработанными белками.

У простоустроенных вирусов нуклеиновая кислота и белки взаимодействуют на мембранах эндоплазматического ретикулума, в результате чего формируется упорядоченная структура.

У сложноустроенных вирусов сборка осуществляется многоступенчато. Вначале нуклеиновые кислоты взаимодействуют с внутренними белками, образуя нуклеокапсиды (сердцевины). Затем нуклеокапсиды выстраиваются с внутренней стороны клеточной мембраны под теми участками, которые модифицированы оболочечными вирусными белками.

6. Выход вирусных частиц из клетки путем лизиса клетки (у простых вирусов) и путем почкования (приобретение суперкапсида оболочечными вирусами).

Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина.

1. Абортивный процесс – когда клетки освобождаются от вируса:

- при инфицировании дефектным вирусом, для репликации которого нужен вирус-помощник, самостоятельная репликация этих вирусов невозможна (так называемые вирусоиды). Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатита B, его Hbs - антигена, аденоассоциированный вирус – в присутствии аденовируса);

- при инфицировании вирусом генетически нечувствительных к нему клеток;

- при заражении чувствительных клеток вирусом в неразрешающих условиях.

2. Продуктивный процесс – репликация (продукция) вирусов:

- гибель (лизис) клеток (цитопатический эффект) – результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц – характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер;

- стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные инфекции) – так называемая вирусная трансформация клетки.

3. Интегративный процесс – интеграция вирусного генома с геномом клетки-хозяина. Это особый вариант продуктивного процесса по типу стабильного взаимодействия. Вирус реплицируется вместе с геномом клетки хозяина и может длительно находиться в латентном состоянии. Встраиваться в ДНК-геном хозяина могут только ДНК-вирусы (принцип “ДНК-в ДНК”). Единственные РНК-вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина – ретровирусы, имеют для этого специальный механизм. Особенность их репродукции – синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина.

Весь цикл репродукции у РНК-вирусов продолжается 4-8 часов, а у ДНК-вирусов – 12-24 часа.

Основы классификации.

В настоящее время вопросами систематики вирусов занимается Международный комитет по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV). Основными таксономическими единицами вирусов являются: отряд (-virales), семейство (-viridae), подсемейство (-virinae), род (-virus) и вид (-virus).

Классификация вирусов 2012 г. включает 7 отрядов (Caudovirales, Herpesvirales, Ligamenvirales, Mononegavirales, Nidovirales, Picornavirales, Tymovirales).

Классификация вирусов по Балтимору (тип НК и способ её репликации) включает в себя следующие группы:

I группа – вирусы, содержащие двуцепочечную (дц) ДНК и не имеющие РНК-стадии (например, герпесвирусы, поксвирусы).

II группа – вирусы, содержащие одноцепочечную (оц) ДНК (например, парвовирусы).

III группа – вирусы, содержащие двуцепочечную (дц) РНК (например, ротавирусы).

IV группа – вирусы, содержащие одноцепочечную (оц) плюс-РНК (например, пикорнавирусы, флавивирусы).

V группа – вирусы, содержащие одноцепочечную (оц) РНК негативной или двойной полярности (например, ортомиксовирусы, филовирусы).

VI группа – вирусы, содержащие одноцепочечную (оц) плюс-РНК и имеющие в процессе жизненного цикла стадию синтеза ДНК на матрице РНК (например, ретровирусы).

VII группа – вирусы, содержащие двуцепочечную (дц) ДНК и имеющие в процессе жизненного цикла стадию синтеза ДНК на матрице РНК (например, вирус гепатита В).

Методы культивирования вирусов.

Вирусы не растут на искусственных питательных средах, а размножаются только внутриклеточно. Для выделения чистых культур вирусов в лабораторных условиях в настоящее время используются следующие живые объекты (биологические модели):

1) лабораторные животные;

2) куриные эмбрионы (развивающиеся куриные эмбрионы – РКЭ);

3) культуры клеток.

Эти исследования включают следующие этапы: заражение биологической модели (животные, куриные эмбрионы, клеточные культуры) патологическим материалом, культивирование, индикация (выявление) и идентификация вирусов.

Выделение вирусов на лабораторных животных. Инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным. Наиболее часто используют мышей, сирийских хомячков, кроликов и редко обезьян. Для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки, клещевого энцефалита) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, нечувствительности к ряду вирусов человека метод используют редко. Тем не менее, животные модели активно используют при открытии новых вирусов, для изучения особенно­стей патогенеза, формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях и изучения эффективности препаратов.

Индикация.

Индикация вируса основана на обнаружении у животных признаков инфекционного заболевания, регистрации их гибели, изучении характера патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах.

Идентификация

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активно­сти вируса с помощью типоспецифических сывороток, проводится в РБН – реакции биологической нейтрализация в опытах на животных.

Таким образом РН (реакция нейтрализации) основана на подавлении соответствующей реакции, феномена, развития инфекционного процесса после введения в организм животного смеси вируса со специ­фичными AT, содержащимися в диагностической сыворотке.

Использование куриных эмбрионов (РКЭ).

Куриные эмбрионы заражают вируссодержащим материалом в асептических условиях стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств вируса. Заражение проводят в аллантоисную или амниотическую полость, на хорион-аллантоисную оболочку, либо в желточный мешок.

Индикация. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке.

Идентификация.

Задержка (торможение) реакции гемагглютинации: смешивают культуральную среду, со­держащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о соответствии вируса антисыворотке.

Выделение вирусов в культурах клеток.

Для получения культур клеток необхо­димо решить четыре главных задачи:

• получить в необходимом количестве свободные (т. е. изолированные друг от друга) клетки;

• создать такие питательные среды и условия, в которых клетки могли бы активно размножаться;

• обеспечить условия, при которых в культурах клеток не могли бы размножаться бактерии;

• определить методы, с помощью которых можно было бы распознавать рост вируса в культуре клеток и идентифицировать его.

Для выделения изолированных (разобщенных), но жизнеспособных клеток из разрушенных тканей, стали использовать обработку их слабым раствором трипсина, разрушающего межкле­точные мостики. Для культивирования клеток были предложены различные среды, содержащие все необходимые для размножения клеток питательные вещества (аминокислоты, основания, витамины и другие), минеральные соли, имеющие оптимальную рН и т. д. К питательным средам добавляли индикатор, по изменению цвета которого можно было судить о метаболизме клеток и их размноже­нии. Было установлено, что в качестве основы, на которой клетки размножаются и образуют монослой, может быть использовано хорошо обработанное стекло пробирок и колб. Для подавления возможного роста бактерий вируссодержащий материал перед посевом его в культуры клеток стали обрабатывать антибиотиками.

В 1949 г. Дж. Эндерс, Т. Веллер и Ф. Роббинс показали, что вирус полиомиелита хорошо размножается в первично-трипсинизированных культурах клеток, полученных из почек обезьян. Основной недостаток первично-трипсинизированных клеток заключается в том, что после нескольких пересевов они перестают размножаться.

Поэтому предпочтением стали пользоваться культуры таких клеток, которые способны размножаться in vitro бесконечно долго. Такие перевиваемые культуры клеток (клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом) получают из опухолевых тканей (HeLa получена из карциномы шейки матки, НЕр-2 – из карциномы гортани; Детройт-6 – из метастаза рака легкого в костный мозг; RН – из опухоли почки человека) или из мутантных клеток с полиплоидным набором хромосом. Однако опухолевые клетки нельзя применять для получения вакцин. Для этих целей используют только культуры таких клеток, которые не содержат никаких контаминантных вирусов и не обладают злокачественностью. Лучше всего этим требованиям отвечают культуры диплоидных клеток.

Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток – клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Вирусы также могут размножаться не только в культурах клеток, образующих монослой на стекле пробирок, но и в суспензиях живых клеток.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие.

В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ (альбумин), обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя.

Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов (среда 199, Эрла, Хэнкса и др.).

При выделении вирусов из различных инфекционных материалов (кровь, моча, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающих наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в сосудах из пластика с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждый сосуд вносят по 0,1-0,2 мл взвеси исследуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикация.

Индикатором наличия вируса в зараженных культурах клеток может служить:

1) развитие специфической дегенерации клеток – цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: крупно- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток (гроздевидная дегенерация клеток). Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур.

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс). Некоторые вирусы обладают особыми рецепто­рами (гемагглютининами), с помощью которых они взаимодействуют с эритроцитами. Такие вирусы обнаруживаются с помощью гемадсорбции (эритроциты адсорбируются на инфицированных вирусами клетках куль­туры тканей);

4) феномен бляшкообразования. В 1952 г. Р. Дюльбекко предложил метод бляшек (негативных колоний), позволяющий производить количественное определение вирусов. Для выделения вирусов монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара, содержащего индикатор нейтральный красный. Флаконы инкубируют при 37 °С. Через 48−96 ч выявляются пятна-бляшки. Они имеют диаметр 1-3 мм и выглядят неокрашенными на розовом фоне. Пятна возникают за счет цитопатического действия вируса;

5) цветная реакция Солка. О росте вирусов в клетках можно судить с помощью индикатора, добавляемого к питательной среде. Если клетки активно осуществляют метаболизм, рН среды сдвигается в кислую сторону, и среда окрашивается в желтый цвет. В случае размножения вируса клетки погибают, рН среды мало меняется, и она сохраняет первоначальный (малиновый) цвет или (при нейтральной рН) приобретает оранжевый или жёлтый;

6) Кроме того, для обнаружения вируса в культурах клеток может быть использована РИФ.

Идентификация.

Реакция тканевой нейтрализации (РТН) или нейтрализация цитопатического действия: в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят диагностическую сыворотку, заражают клеточную культуру и инкубируют. При наличии цитопатогенного эффекта в контроле без сыворотки и отсутствии такового в присутствии сыворотки делают вывод о том, что культура была заражена вирусом, соответствовавшим антителам примененной сыворотки. Учёт проводится при помощи микроскопа; кроме того, наблюдается изменение проявления цветной пробы.

Реакция задержки гемадсорбции (РЗГА) – нейтрализация реакции гемадсорбции в клеточной культуре; в клеточной культуре после после добавления смеси вируса и диагностической сыворотки не наблюдается явления гемадсорбции. Учёт также проводится при микроскопии.