12. Спорообразование. Патогенные бактерии, образующие споры: бациллы и клостридии. Методы обнаружения спор.

Ответ.

Споры – специфическим образом устроенные покоящиеся формы бактерий, выдерживающие влияние высокой температуры, радиации, вакуума, различного рода токсических веществ и других неблагоприятных факторов, приводящих к гибели вегетативные клетки.

Спора характеризуется: снижением уровня обмена веществ и высокой устойчивостью к неблагоприятным факторам.

Причины перехода бактерий к спорообразованию: недостаток питательных веществ; недостаток воды; накопление продуктов обмена и др. неблагоприятные условия.

Эндоспоры – это бактериальные споры, которые формируются внутри материнской клетки.

У некоторых бактерий могут образовываться экзоспоры (только у метанокисляющих бактерий) и цисты (шарообразная клетка, у некоторых видов азотобактерий). Это тоже покоящиеся формы, но в этом случае сама бактерия как будто покрывается защитной оболочкой, а не образует спору внутри себя.

Среди бактерий споры образуют:

• бациллы (диаметр споры не превышает поперечника вегетативной клетки), 

• клостридии (диаметр споры больше поперечника вегетативной клетки – теннисная ракетка).

К тому же бациллы по типу дыхания – аэробы, а клостридии – строгие (облигатные) анаэробы.

Известны и спорообразующие кокки.

Расположение спор в клетке бактерии: центрально (в центре), субтерминально (ближе к концу), терминально (на конце клетки).

Строение споры. Центральная часть споры представлена сердцевиной, которая окружена цитоплазматической мембраной (ЦПМ), к которой прилегает зачаточный пептидогликановый слой, затем слой коры – кортекса. На поверхности кортекса есть внешняя мембрана. Снаружи споры окружены многослойной оболочкой.

Химический состав спор. В сердцевине – дипиколиновая кислота (термоустойчивость), ионы Ca⁺⁺, НМБ (низкомолекулярные белки, связываются с ДНК, стабилизируя её), сердцевина обезвожена (H₂O) и окружена мембранами. Затем слой муреина – кортекс, всё окружает эндоспориум.

Функция спор: сохранение бактерии в неблагоприятных условиях; расселение бактерии. 

Споры у бактерий не служат для размножения!

Cпорообразование (инспоруляция) – это образование споры под контролем комплекса специальных генов.

Стадии спорообразования:

1. Подготовительная – изменяется обмен веществ, завершается удвоение ДНК. Клетка содержит 2 или более нуклеоида. Один локализован в спорогенной зоне, остальные в цитоплазме спорангия.

2. Стадия предспоры – со стороны ЦПМ вегетативной клетки происходит врастание двойной мембраны, в результате образуется проспора, окруженная 2-мя мембранами.

3. Образование оболочек – между мембранами образуется зачаточный пептидогликановый слой, затем откладывается слой коры, и вокруг наружной мембраны формируется оболочка.

4. Созревание споры – завершение образования споры (происходит её уплотнение).

5. Разрушение родительской клетки.

В оптимальных условиях происходит проростание споры. Сначала она активно поглощает воду (H₂O) и набухает, усиливается дыхание, возрастает активность ферментов. Затем спора лопается и из неё выходит вегетативная клетка.

Окраска по методу Ожешки.

1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% р-р хлористоводородной к-ты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.

2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.

3. Окрашивают препарат по Цилю-Нельсону.

Споры бактерий преобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Окраска по методу Циля-Нельсона.

1. На фиксированный мазок наносят карболовый р-р фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подогревают до появления паров 3 раза.

2. На мазок наносят 5% р-р серной к-ты на 5 сек для обесцвечивания.

3. Промывают.

4. Докрашивают мазок метиленовым синим в течение 3 минут

5. Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Дополнительные методы выявления спор.

Окрашивание спор по методу Златогорова. Мазок фиксируют над пламенем горелки. Затем на поверхность мазка помещают полоску фильтровальной бумаги, окрашенной основным феноловым фуксином Циля. Бумагу смачивают 3-5 каплями воды. Препарат подогревают в течение 5-7 минут, обесцвечивают 3%-ным водным раствором серной кислоты в течение 5-10 секунд и промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят метиленовым голубым в течение 2-3 минут, после чего мазок промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий.

Окрашивание спор по Пешкову. После фиксации препарата над пламенем горелки мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 15-20 секунд, подогревая над пламенем спиртовки. Препарат промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного в течение 30 секунд. Затем препарат промывают водой и высушивают. При этом методе споры окрашиваются в голубой или синий цвет, а вегетативные формы – в розовый.

Окраска спор по методу Виртца в модификации Саватеева. На фиксированный в пламени мазок наносят 3-2 капли дистиллированной воды и накладывают полоску фильтровальной бумаги, окрашенной 5%-ным раствором малахитового зеленого. Препарат нагревают до появления паров (3-4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении воды ее добавляют. После остывания препарата краску с бумагой смывают струей воды и сразу же на мокрую поверхность препарата кладут бумагу, окрашенную сафранином. Через 30-40 сек мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют. При этом свободно лежащие споры окрашены в зеленовато-голубой цвет, споры внутри микробных клеток – темно-зеленые, вегетативные формы – красные.

Окраска спор по методу Виртца в модификации Шеффелера и Фултона. На фиксированный в пламени препарат наносят 5%-ный водный раствор малахитового зеленого и нагревают до появления паров (3-4 раза) в течение 30-60 сек. Препарат промывают водой и докрашивают 0,5 %-ным водным раствором сафранина в течение 30 сек. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, где наблюдают споры зеленого цвета, а вегетативные клетки – красными.

Окраска спор по Битеру. Приготовленный и высушенный мазок обрабатывают 10%-ным раствором формалина 10 мин, промывают водой, высушивают. Далее окрашивают аммиачным метиленовым синим в течение 3 мин, нагревая стекло до закипания жидкости. После промывания водой и высушивания докрашивают мазок 0,5%-ным раствором сафранина 3-5 мин. Вновь промывают, высушивают и микроскопируют. Споры наблюдаются окрашенными синим цветом, вегетативные клетки – красные.