5. Нарисуйте схему ифа при исследовании клеща на наличие боррелий. Подпишите этапы и компоненты.

Метод ИФА включает 3 основных этапа:

1) образование иммунного комплекса «антиген (исследуемое вещество) (в данном случае антиген ИКБ) – специфическое к нему антитело (сыворотка больного)»;

2) формирование связи конъюгата с образовавшимся на предыдущем этапе иммунным комплексом или со свободными местами связывания (детерминантами);

3) преобразование субстрата под действием ферментной метки в регистрируемый сигнал в результате биохимической реакции.

Антиген ИКБ + Антитела сыворотки + метка с ферментом

Ответы на ситуационные задачи

Задача №1. В стационар поступил больной с подозрением на сифилис. В области половых органов эрозия, напоминающая твердый шанкр. Считает себя больным 5-7 дней. Предложите схему лабораторного обследования с учетом сроков заболевания.

Ответ:

Так как в области половых органов наблюдается эрозия, напоминающая твердый шанкр, то можно предположить, что это проявление первичного раннего сифилиса

Проведём лабораторное обследование с учетом сроков заболевания по следующей схеме.

• Бактериоскопическое исследование отделяемого шанкра – темнопольная микроскопия, при которой в качестве исследуемого материал используют отделяемое твердого шанкра, каплю исследуемого материала помещают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом, на которое наносят иммерсионное масло, при микроскопии используют специальный темнопольный конденсор, объектив х40 и окуляр х10, в темном поле T. pallidum выглядит в виде тонкой серебристой спирали, совершающей плавные движения:

Проведём исследование окрашенных препаратов: импрегнация серебром по Морозову и окраска по Романовскому-Гимзе:

• метод серебрения по Морозову – Treponema pallidum выглядит черной или темно-коричневой:

• окраска по Романовскому-Гимзе – розовое окрашивание, непатогенные трепонемы в фиолетовый или синий цвет:

• Неспецифическая серодиагностика – реакция микропреципитации (РМП), в её основе лежит образование преципитата в виде хлопьев белого цвета при добавлении кардиолипинового антигена к плазме или сыворотке крови больного сифилисом. Результаты реакции могут быть положительными (++++, +++, ++) или отрицательными. Для реакции микропреципитации выпускается кардиолипиновый антиген АКРЕМИТ - раствор трех высокоочищенных липидов (кардиолипина, лецитина и холестерина) в этиловом спирте.

Специфическая серодиагностика:

• ИФА (IgM и IgG) - принцип метода заключается в выявлении сорбированных в лунках пластикового планшета антигенов возбудителя сифилиса с помощью антител сыворотки крови больного, конъюгата (антиглобулиновые антитела, меченые ферментом) и субстрата (вещество, изменяющее окраску под влиянием фермента). Для сенсибилизации лунок планшетов используют антигены следующих видов:

- лизатные антигены (получают путем разрушения бледных трепонем ультразвуком);

- пептидные антигены (получают в результате химического синтеза);

- рекомбинантные антигены (получают с помощью методов генной инженерии).

• РНГА (РПГА) – основана на склеивании эритроцитов (гемагглютинации), соединенных с антигеном T. pallidum, при добавлении к ним антител сыворотки крови больных сифилисом.

Результаты реакции оцениваются следующим образом:

- кольцо из агглютинированных эритроцитов в виде “зонтика” – положительный результат (++++, +++, ++);

- неплотное кольцо, эритроциты образуют рыхлый осадок на дне лунки – сомнительный результат (±, +);

- отсутствие агглютинации, эритроциты располагаются на дне лунки в виде ”пуговки” – отрицательный результат (-).

Задача №2. Прочитайте отрывок из рассказа Михаила Булгакова «ЗВЕЗДНАЯ СЫПЬ». Для какого периода заболевания характерны выявленные симптомы? Предложите схему лабораторного обследования с учетом периода заболевания.

Михаил Булгаков ЗАПИСКИ ЮНОГО ВРАЧА

ЗВЕЗДНАЯ СЫПЬ

«….Это он! Чутье мне подсказало. На знание мое рассчитывать не приходилось.

Знания у меня, врача, шесть месяцев тому назад окончившего университет, конечно, не было. Я побоялся тронуть человека за обнаженное и теплое плечо (хотя бояться было нечего) и на словах велел ему:

- Дядя, а ну-ка, подвиньтесь ближе к свету!

Человек повернулся так, как я этого хотел, и свет керосиновой лампы-молнии залил его желтоватую кожу. Сквозь эту желтизну на выпуклой груди и на боках проступала мраморная сыпь. Как в небе звезды, подумал я и с холодком под сердцем склонился к груди, потом отвел глаза от нее, поднял их на лицо. Передо мной было лицо сорокалетнее, в свалявшейся бородке грязно-пепельного цвета, с бойкими глазками, прикрытыми напухшими веками.

Это он - сифилис, - вторично мысленно и строго сказал я. В первый раз в моей врачебной жизни я натолкнулся на него, я - врач, прямо с университетской скамеечки брошенный в деревенскую даль в начале революции. На сифилис этот я натолкнулся случайно. Этот человек приехал ко мне и жаловался на то, что ему заложило глотку. Совершенно безотчетно и не думая о сифилисе, я велел ему раздеться, и вот тогда увидел эту звездную сыпь. Я сопоставил хрипоту, зловещую красноту в глотке, странные, белые пятна в ней, мраморную грудь, и догадался.….

- Вот что, - сказал я, - видите ли... Гм... По-видимому... Впрочем, даже наверно... У вас, видите ли, нехорошая болезнь - сифилис...

Сказал это и смутился. Мне показалось, что человек этот очень сильно испугается, разнервничается... Он нисколько не разнервничался и не испугался.»

Ответ: выявленные симптомы характерны для вторичного (позднего) сифилиса.

Вторичный сифилис - это фаза генерализованной инфекции с поражением кожи, внутренних органов и нервной системы. Трепонемы в большом количестве поступают в кровь и распространяются по организму. Вторичный сифилис наступает через 6-8 недель после появления твердого шанкра или через 9-10 недель после заражения. Клинически вторичный сифилис проявляется появлением на коже и слизистых оболочках беспорядочно расположенных высыпаний (розеол, папул, пустул). Элементы высыпаний отличаются поверхностным расположением и исчезают без следа.

Проведём лабораторное обследование с учетом сроков заболевания по следующей схеме.

• Бактериоскопическое исследование элементов сыпи, ПЦР.

• Серодиагностика – неспецифическая (РМП) и специфическая (РНГА, РИФ, ИФА – IgM и IgG).

РИФ используется для ранней диагностики сифилиса. Эта реакция дает положительные результаты к концу первой недели с момента инфицирования. Для постановки этой реакции на предметное стекло наносят взвесь живых патогенных бледных трепонем штамма Никольс (из яичка инфицированных кроликов), высушивают и фиксируют ацетоном. На фиксированный препарат наносят исследуемую сыворотку и после экспозиции промывают. Затем препарат обрабатывают меченой флюорохромом сывороткой против иммуноглобулинов человека. При наличии в сыворотке крови больного антитрепонемных антител происходит образование комплекса из фиксированного на стекле возбудителя, антител исследуемой сыворотки и флюоресцирующего компонента (сыворотка против иммуноглобулинов, меченая флюорохромом). При исследовании в люминесцентном микроскопе обнаруживаются светящиеся трепонемы.

Результаты теста определяются по интенсивности свечения:

- желто-зеленое яркое свечение - ++++;

- зеленое свечение - +++;

- бледно-зеленое свечение - ++;

- еле заметное свечение - +;

- отсутствие свечения – отрицательный результат.

Задача №3. В мазках из язвочки в ротовой полости обнаружены микроорганизмы, напоминающие T. pallidum. Пациент отрицает возможность заражения. Возможны ли другие пути заражения, кроме полового?

Могут ли быть спирохеты в составе нормофлоры в полости рта, если да, то какие виды? Какие методы лабораторной диагностики следует использовать для постановки диагноза и почему?

Ответ:

Помимо полового, возможны и другие пути передачи:

1) контактный: а) прямой; б) непрямой.

2) трансплацентарный (от матери новорожденному);

3) трансфузионный.

У любого здорового человека в полости рта обитает большое количество сапрофитных спи­рохет. Они обнаруживаются преимущественно в десневых кар­манах.

В полости рта постоянно находятся сапрофитные спирохеты, относящиеся к трем родам семейства Spirochaetaceae:

1) Borrelia;

2) Treponema;

3) Leptospira.

Боррелии представляют собой спиральные клетки с 3— 10 крупными, неровными витками. Грамотрицательны. По Ро­мановскому—Гимзе окрашиваются в сине-фиолетовый цвет. Облигатные анаэробы. Обитателем полости рта является Borrelia buccalis.

Трепонемы имеют вид туго закрученных спиралей. Завитки равномерные, мелкие. Грамотрицательны. Строгие анаэробы. В полости рта присутствуют: Treponema macrodentium, Т. microdentium (по морфологии очень сходна с возбудителем сифи­лиса Т. pallidum), T. vincentii.

Лептоспиры представлены в полости рта Leptospira dentium. По морфологическим признакам L dentium не отличается от других представителей рода. Клетки имеют форму спиралей с мелкими витками. Один или оба конца могут быть загнуты в виде крючка. Облигатные аэробы.

В чистой культуре спирохеты, встречающиеся в полости рта, не патогенны для человека и животных. Они вызывают патологические процессы в сочетании с другими микроорганизмами, кокками, фузобактериями, вибрионами. Большое количество спирохет, обнаруживается при язвенном стоматите, ангине Венсана, в зубодесневых карманах при тяжелых формах пародонтита, в кариозных очагах и некротизированной пульпе.

Лабораторная диагностика основана на микроскопии некротизированного или язвенного материала в темном поле или окраске по Романовскому-Гимзе для изучения морфологии микроорганизмов. Для выявления сифилитического поражения используют также серологические реакции, которые у больных становятся стойко положительными, начиная с 4 недели от момента образования твердого шанкра (РМП, ИФА, РИФ).

Задача №4. Женщина проходит обследование для прерывания беременности. Реакция микропреципитации положительна. Какой антиген используются в этой реакции? Нужно ли продолжать исследование?

Ответ:

В РМП используют кардиолипиновый диагностикум. Исследование нужно продолжить, поскольку данная реакция является неспецифичной. Следует провести трепонемные тесты.

Задача №5. При обследовании пациента с подозрением на лептоспироз из крови бактериологическим методом выделена L. interrogans, но в сыворотке больного антитела не обнаружены.

1. Как называется метод выделения микробов из крови пациента?

2. На какие питательные среды осуществляли посев?

3. Как удалось определить, что именно лепроспиры этого вида?

4. Какую реакцию и почему использовали для серодиагностики лепроспироза?

Ответ:

1. Метод выделения микробов из крови пациента – бактериоскопический.

2. Посев осуществляли питательные водно-сывороточные среды, среды Фервоорта-Вольфа, Терских, Уленгута, Любашенко, полусинтетическую твин-альбуминовую среду.

3. Удалось определить, что именно лепроспиры этого вида за счёт того, что выделенную чистую культуру идентифицируют в РА с помощью типовых агглютинирующих сывороток, определяют серогруппу и серовар.

4. Проводили РМА (специфическая). Эта реакция проводится с использованием в качестве антигена живых лептоспир. При смешивании культур с иммунной сывороткой крови происходит склеивание лептоспир в виде “тяжей” или “кос”, что выявляется при темнопольной микроскопии. РМА позволяет не только выявлять антитела в сыворотке крови больных и определять их титр, но и устанавливать серогруппу возбудителя. РМА становится положительной с 10-11 дня заболевания. Эта реакция даёт наиболее точные результаты.

Задача №6. Группа молодых людей купалась в озере. Через 5-6 дней у трех из них повысилась температура, появилась желтуха.

Какое заболевание могло и возникнуть и почему? Охарактеризуйте возбудителя заболевания. Какие методы диагностики следует использовать? Какой материал необходимо исследовать и в какие сроки?

Ответ:

Заболевание – лептоспироз, проникновение возбудителя в организм при купании в заражённой воде.

Возубдителем болезни является Leptospira interrogans – тонкие спирохеты размером 0,07÷0,15x6÷24 мкм. Концы клеток утончены и загнуты под углом. Тело лептоспир имеет 12-18 спиральных первичных завитков. Завитки лептоспир плотно прилегают друг к другу, поэтому при микроскопии в темном поле они выглядят в виде “нитки жемчуга”. Кроме первичных завитков лептоспиры имеют на концах крючки, которые придают клеткам S-образную форму. Лептоспиры являются грамотрицательными бактериями, однако слабо окрашиваются анилиновыми красителями, поэтому трудно различимы на препаратах, окрашенных по Граму или Романовскому-Гимзе (светло-розовый цвет). Они хорошо выявляются при микроскопии в темном поле. Для выявления лептоспир используют также методы импрегнации серебром по Фонтано-Трибондо или Левадити. В этом случае клетки лептоспир окрашиваются в черно-коричневый цвет и хорошо видны на светлом фоне. Лептоспиры не образуют спор и капсул. Обладают активной подвижностью: совершают вращательные, поступательные и сгибательные движения. Размножаются поперечным делением. Основными структурными элементами лептоспир являются осевая нить, цитоплазматический цилиндр (ЦПЦ) и наружный покров.

Материалом для исследования служит кровь, сыворотка крови, СМЖ, моча. При необходимости исследуют воду, пищевые продукты. В диагностике лептоспироза применяют бактериоскопический, бактериологический и серологические методы, а также ПЦР и биопробу. В течение первой недели заболевания (во время бактериемии) проводят микроскопическое исследование крови, посев крови на питательные среды, ПЦР, заражение лабораторных животных. В конце первой – начале второй недели в крови больных появляются антитела, которые выявляют реакцией микроагглютинации лептоспир (РМА), реакцией агглютинации на стекле (РА), иммуноферментным методом (ИФА).

Следовательно, в данном случае целесообразно провести микроскопическое исследование крови, посев крови на питательные среды, ПЦР.

Задача №7. В медпункт обратился мужчина, который после посещения леса обнаружил в подмышечной впадине присосавшегося клеща. Как можно определить наличие боррелий в клеще? Что делать, если они обнаружены? Нужно ли проводить профилактические мероприятия среди контактных лиц?

Ответ:

Наличие боррелий в клеще определяют посредством бактериоскопии, делают окраску по Романовскому-Гимзе. На поздних этапах – ИФА, ПЦР, иммуноблоттинг.

При обнаружении боррелий в клеще необходимо сообщить в СЭС, госпитализировать в инфекционное отделение, назначить антибиотикотерапию.

Для предупреждения развития боррелиза среди контактных лиц следует проводить санитарно-профилактические мероприятия, так как возможен риск повторного заражения.

Ответы на тестовые задания

1. БЛЕДНАЯ ТРЕПОНЕМА ХАРАКТЕРИЗУЕТСЯ:

А. лёгкостью выделения;

Б. грамположительной окраской;

В. чувствительностью к пенициллину;

Г. хорошим ростом в аэробных условиях;

Д. образованием капсул.

2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СПИРОХЕТ:

А. наличие оболочки;

Б. оформленное ядро;

В. наличие осевой нити;

Г. антигенные свойства.

3. СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ:

А. желчный бульон;

Б. среда Раппопорт;

В. среда Арисовского – Гельцера;

Г. среда Уленгута;

Д. печёночный агар.

4. ТЕРАПИЯ СИФИЛИСА:

А. препараты мышьяка;

Б. биомицин;

В. пенициллин;

Г. специфическая сыворотка;

Д. бактериофаг.

5. КАКОЙ МЕТОД ОКРАСКИ ИСПОЛЬЗУЮТ ДЛЯ ОКРАСКИ СПИРОХЕТ:

1. Грама

2. Бури-Гинса

3. Морозовой

4. Романовского-Гимза

5. Здродовского

6. ПЕРЕНОСЧИКАМИ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА ЯВЛЯЮТСЯ

1. блохи

2. вши

3. иксодовые клещи

4. аргасовые клещи

6. ДЛЯ БОРРЕЛИЙ НЕ ХАРАКТЕРНО:

1. наличие 3-5 крупных неравномерных завитков и заостренных концов

2. способность расти на простых питательных средах

3. подвижность

4. способность культивироваться в куриных эмбрионах.

6. ВОЗБУДИТЕЛЕМ СИФИЛИСА ЯВЛЯЕТСЯ:

1. Treponema pallidum

2. Trypanosoma gambiense

3. Treponema orale

4. Trichomonas vaginalis

5. Leptospira interrogans

6. НАЗОВИТЕ ИСТОЧНИК ИНФЕКЦИИ ПРИ СИФИЛИСЕ:

1. больной человек

2. больное животное

3. насекомые

6. ТИПИЧНЫМ ПРОЯВЛЕНИЕМ ПЕРВИЧНОГО СИФИЛИСА ЯВЛЯЕТСЯ:

1. сыпь

2. гуммы

3. спинная сухотка

4. твердый шанкр

5. прогрессивный паралич

6. КАКОЙ ПАТОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ИСПОЛЬЗУЮТ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА:

А. кровь

Б. моча

В. фекалии

Г. спиномозговая жидкость

Д. содержимое язвы, бубона

Е. мокрота.

Таблица 1.

Род/вид спирохет	Treponema pallidum	Borrelia burgdoferi.		Leptospira inerrogans
Характеристики микроорганизмов
Вызываемые заболевания	сифилис	болезнь Лайма		лептоспироз
Особенности морфологии (диаметр и количество завитков)	0,25-0,35 мкм, 8-12	0,2-0,6 мкм, 3-10		0,1 мкм,, 12-18
Окраска по Романовскому -Гимзе	бледно-розовые	сине-фиолетовые		светло-розовые
Способность к образованию цист	+	+		-
Антигенная структура	белковые АГ, полисахаридные АГ, кардиолипиновый АГ	BSK-II, BSK-H, 28-35°С и атмосфера углекислого газа		белковый, ЛПС, полисахаридный, гликолипидные
Факторы патогенности	белки внешней мембраны Tromp1 и Tromp2, гиалуронидаза, ускользание от фагоцитоза, периплазматические жгутики, формирование полимембранных фагосом	р41, р93, osp А, В, С, D, Е, F		эндотоксин, гемолизин, липаза, гиалуронидаза, плазмокоагулаза, фибринолизин, ДНКаза, эстераза, уреаза, цитотоксины, спиралевидная форма, подвижность
Тип дыхания	микроаэрофилы	микроаэрофилы.		аэробы
Особенности культивирования	нет	нет		жидкие (опалесценция) или полужидкие питательные средах, содержащие кровь, сыворотку крови (5-10%), жирные кислоты, витамины В1 и В12 (среды Уленгута, Любашенко, Терских, Фервоорта-Вольфа, твин-альбуминовая), 28-30°С, медленно, на плотных – круглые колонии диаметром 1-3 мм R- или S-формы, глубокое врастание колоний в процессе роста вглубь плотной среды, глюкоза и сахароза – КГ,
Характеристика эпид.процесса
Источник возбудителя инфекции	больной человек	клещи		грызуны, насекомоядные, с/х животные
Механизмы передачи инфекции	контактный			контактный
Восприимчивый организм (группы риска)	люди			люди, животные
Клинические особенности заболевания
Инкубационный период (длительность)	3-4 недели	3-32 дня		4-14 дней
Периоды заболевания и их основные симптомы	- инкубационный период; - первичный сифилис (твердый шанкр); - вторичный сифилис (высыпания); - третичный сифилис (гуммы).	Патогенез включает стадию локальной инфекции и стадию диссеминации и органных поражений		- фаза заражения - фаза генерализации инфекции; - фаза токсинемии; - фаза формирования иммунитета.
Особенности иммунитета	ненапряжённый, нестерильный, возможны супер- и реинфекция	гуморальный, видоспецифический		серотипспецифический