3 курс / Микробиология / инт07 (Лабораторная диагностика вирусов)

Лабораторная диагностика вирусных инфекций

   Основана на обнаружении возбудителя в острой стадии болезни и на выявлении прироста антител у реконвалесцентов. Для некоторых инфекций разработаны экспресс-методы, которые позволяют обнаружить возбудителя непосредственно в пробах от больного. Используют:

1. Микроскопический

2. Вирусологический

3. Серологический

4. Экспресс-методы.

   Выбор метода определяется характером заболевания, предполагаемым возбудителем и решается в каждом случае  в зависимости от периода болезни и  возможности лаборатории.

   Микроскопический метод. Вирус можно непосредственно  увидеть с помощью электронного микроскопа, но это доступно только крупным лабораториям. Недостатком является также то, что при небольшой концентрации возбудителя в изучаемом препарате его можно не увидеть. 

   Можно использовать иммерсионный микроскоп. Проводится патогистологическое исследование тканей при некоторых вирусных инфекциях. Диагноз может быть установлен при обнаружении телец Гварниери при натуральной оспе, Бабеша-Негри при бешенстве и пр.

   Исследование в световом микроскопе применяется для определения изменений в культурах клеток, зараженных вирусами.

   Возможно использование люминесцентных микроскопов. При  обработке нативных и фиксированных препаратов клеток, предположительно содержащих вирусы или их нуклеиновые кислоты флюорохромами, например, акридин оранжевый - культуры, содержащие ДНК светятся ярко-зелёным цветом, РНК - кирпично- красным.

   

Вирусологический метод.

При проведении этого метода выявляют вирус в исследуемом материале (индикация) с последующей идентификацией. Обнаружить вирус в исследуемом материале можно по: 

1. цитопатическому действию (ЦПД);

2.  цветной пробе (ЦП);

3.  бляшкообразованию (БО);

4.  в реакции гемагглютинации (РГА);

5.  в реакции гемадсорбции (РГад);

6.  путём заражения животного;

7.  путём заражения куриного эмбриона.

Суть ЦПД.  Здоровую культуру клеток обрабатывают исследуемым материалом. Если вирус есть в материале он оказывает цитопатическое действие на клетки, которые погибают, открепляются от стекла, меняют свою форму. Таким образом нарушается монослой культуры клеток.

Суть ЦП. Если культура клеток развивается нормально, клетки выделяют кислые продукты и цвет среды (изначально красный) постепенно в процессе инкубации меняется в сторону желтого. Если культуру клеток обработать исследуемым  материалом в котором будут находиться вирусы, они погубят клетки, не будут выделяться кислые продукты и цвет среды не изменится.

Суть БО. Монослой клеток, обрабатывают исследуемым материалом, покрывают тонким слоем питательной среды с 1,5% агара и красителем нейтральным красным. Через несколько дней культивирования в термостате среди прижизненно окрашенных клеток обнаруживаются бесцветные бляшки, состоящие из дегенерированных клеток. Их количество соответствует числу внесенных вирусных частиц.

Эти три теста основаны на повреждающем культуру клеток действии вирусов. Но, а если вирус не повреждает клеток. Как быть тогда? Используют знания других биологических свойств вирусов. Так некоторые вирусы, а точнее их гемагглютинины связываются с рецепторами чувствительных эритроцитов, вызывая их агглютинацию. На этом основана РГА. К исследуемому материалу налитому в лунку планшетки прибавляют эритроциты. Если образовался «зонтик» - вирус есть в материале.

РГад основана на прикреплении эритроцитов  к участкам поверхности инфицированных клеток, где локализованы гемагглютинины. Культуру клеток обрабатывают исследуемым материалом, а затем прибавляют взвесь эритроцитов. Если вирус есть в клетках, на них адсорбируются эритроциты. Одной из распространенных моделей для вирусологических исследований являются лабораторные животные. Исследуемый материал вводят животному. О наличии вируса в исследуемом материале судят по клиническим проявлениям.

Для обнаружения и определения вируса применяют и куриный эмбрион. Исследуемый материал вводят в то или иное образование куриного эмбриона и о присутствии вирусов в материале судят по  изменениям в нём.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ. Проводится с использованием специфических антител (известных сывороток) в реакциях нейтрализации (РН). Она заключается в нейтрализации инфекционных свойств возбудителя антителами, что основано на специфическом взаимодействии антител с антигеном. Используются те тест-системы, которые брали для индикации. Идентификация осуществляется в:

1. РН ЦПД

2. РН ЦП

3. РН БО

4. В реакции торможения гемагглютинации (РТГА)

5. Реакции задержки ГАДС

6. Реакции нейтрализации на животном

7. Реакции нейтрализации на курином эмбрионе

8. РСК

9. В реакции преципитации

10. Реакции обратной пассивной гемагглютинации (РОПГА)

Серологический метод

Предусматривает обнаружение антител к тем или иным вирусам в сыворотке крови больных и переболевших. Часто диагноз выставляется ретроспективно. Антитела определяются в парных сыворотках. Первый раз сыворотку крови получают от больного через несколько дней заболевания и определяют в ней количество антител. Второй раз у этого же больного получают сыворотку через 1-2 недели и также определяют количество антител. Лишь четырехкратное нарастание титров антител позволяет поставить диагноз. Антитела определяют в тех же реакциях (по названию), что используют для идентификации вирусов (см. выше).

Экспресс-методы. Для быстрого обнаружения вируса в исследуемом материале используют реакцию иммунофлюоресценции  (РИФ), радио иммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА). 

Для диагностики вирусных инфекций применяют  реакцию молекулярной гибридизации, полимеразную цепную реакцию.