Большой практикум / Белки и ДНК / Лабораторные по экспрессии белков

Рисунок 3 – Профиль элюции

Хроматография проводилась при длине волны 280 нм. На хроматограмме были выявлены 3 пика. Первый пик (время удерживания 6,15 мин, абсорбция 0,7475) – это молекулы, не связанные с сорбентом, элюирующиеся в свободном объеме. Было собрано две фракции пиков в объеме 2 мл, связывающихся с колонкой и последовательно элюирующихся при возрастании ионной силы. 2 пик со временем удерживания 16,883 мин, абсорбцией 0,5) и 3 пик со временем удерживания 19,483 мин, абсорбцией

0,4433).

6. Отсоединить колонку, присоединить коннектор, перенести шланги для элюента в емкость с водой и промыть систему поочередно через шланги для буферов B и A, используя опцию “purge”.

Вывод: при ионообменной хроматографии ионы и полярные молекулы разделяются на основе их заряда. Сорбент имеет на поверхности ионные функциональные группы, которые взаимодействуют с ионами аналита противоположного заряда. Во время ИОХ белки разделяются в соответствии с их суммарным зарядом, а образцы элюируют градиентом соли NaCl. В результате хроматографии было собраны фракции двух пиков, которые затем подвергли дальнейшему исследованию с помощью электрофоретического анализа.

Работа 3.3. Обессоливание апо-белков на био-геле

Материалы и оборудование:

11

1.Хроматографическая колонка, заполненная био-гелем (5 мл);

2.Растворы для проведения хроматографии:

(A)20 мМ Трис-HCl pH 7.0 – 100 мл

3.Хроматографическая установка BioLogic (BioRad);

4.Пробирки для сбора фракций;

5.Набор автоматических пипеток и наконечники к ним;

6.Фракция апо-белка в буфере с 6 М мочевиной.

Ход работы:

1.Буфер A выдержать при комнатной температуре не менее часа, затем на хроматографе поместить шланг для элюента в емкость с буфером. Прокачать поочередно буфер A через систему с помощью опции “purge” пока кондуктивность не приобретет постоянную величину;

2.Отсоединить коннектор, присоединить колонку с био-гелем к системе и запустить программу “desalt” (промыть колонку 15 мл буфера A, скорость элюции 1 мл/мин) для уравновешивания колонки. Нажать

“pause”;

3.Нанести 500 мкл образца на колонку с помощью пипетки, отжать “pause” и собрать пиковые фракции в пробирки для сбора образцов;

4.Отсоединить колонку, присоединить коннектор, перенести шланг для элюента в емкость с водой и промыть систему, используя опцию

“purge”;

5.Пробирки с образцами хранить при 4 .

Вывод: обессоливание проводится для очистки белковых молекул от низкомолекулярных соединений, в частности NaCl и мочевины. Были собраны пиковые фракции в объеме 2 мл. В дальнейшем собранная фракция подвергается электрофоретическому анализу. Этот образец мы использовали только для определения концентрации белка.

Работа 4. Анализ полученных растворов белков электрофорезом по методу Лэммли

Цель работы: определение состава белковых препаратов, полученных на разных стадиях выделения и очистки рекомбинантных белков, и определение их молекулярной массы.

Материалы и оборудование:

1.Растворы буферов и реагентов:

Буфер C: 0,5 М Tris-HCl pH 6.8 (3 г Tris на 50 мл); Буфер B: 1,5 М Tris-HCl pH 8.8 (9 г Tris на 50 мл);

12

Раствор AA/bisAA (30 г акриламида, 0,8 г бис-акриламида на 100 мл);

Буфер для э/ф: x1 pH 8.3 (3 г Tris, 1 г SDS, 14 г глицин на 1 л);

10% раствор додецилсульфата натрия (SDS);

10% раствор персульфата аммония;

Пробка: AA/bisAA – 500 мкл, ТЕМЕД – 5 мкл, ПСА -10 мкл; Разделяющий гель: 1238 мкл воды, 937 мкл буфер B, 1500 мкл AA/bisAA, 37,5 мкл SDS, 7,5 мкл ТЕМЕД, 15 мкл ПСА; Концентрирующий гель: 1000 мкл воды, 500 мкл буфер C, 300 мкл AA/bisAA, 20 мкл SDS, 5 мкл ТЕМЕД, 10 мкл ПСА;

Окраска геля: кумасси G-250 – 2 г, CH3COOH – 45 мл, 50% C2H5OH – 454 мл;

Лизирующий буфер (на 24 мл): 14,28 мл воды, 1,5 мл Tris-HCl pH 6.8, 3

мл 10% SDS, 3 мл glycerol, 0,3 мл Mercaptoethanol, 20 мкл 0,5% БФС;

2.Стеклянные пластины для заливки геля;

3.10% раствор уксусной кислоты для отмывки геля после окрашивания;

4.Водяной термостат (60 );

5.Образцы клеток до и после индукции, образцы белковых растворов до

ипосле хроматографической очистки;

6.Набор автоматических пипеток и наконечников к ним;

7.Камера для проведения электрофореза;

8.Источник постоянного тока.

Ход работы:

1.Стеклянные пластины для электрофореза соединить с помощью зажимов;

2.В соответствии с инструкцией провести заливку геля между пластинами;

3.Приготовить образцы белковых растворов. Для этого отобрать 50 мкл анализируемого раствора, добавить 25 мкл денатурирующего раствора и выдержать 5 мин при 100 ;

4.Аналогично приготовить образцы лизированных клеток E. coli (до и после индукции из работы №1). Клетки должны полностью раствориться, в противном случае повторить температурную обработку;

5.В камеру для электрофореза поместить пластины с залитым гелем и внести буфер;

6.В лунки полученного геля нанести по 10 мкл полученных образцов денатурированных белков и клеток. В одну из лунок внести 2 мкл раствора стандартных белков;

13

7.Подсоединить к электродам источник тока и включить напряжение;

8.Электрофорез проводить при постоянной силе тока 50 мА. За ходом процесса следить по передвижению полосы бромфенолового красителя;

9.После окончания процесса отключить напряжение и вынуть пластины с гелем;

10.Пластины рассоединить, гель промыть дистиллированной водой и снять со стекла;

11.Поместить гель в стакан с раствором для окраски. Выдержать 30 мин при 50 ;

12.Провести отмывку геля с помощью 10% раствора уксусной кислоты при той же температуре в течение 20-30 мин. Процедуру промывки повторить дважды;

13.Отсканировать полученный гель. Оценить степень чистоты полученных белковых препаратов;

Рисунок 5 – Гель-электрофорез

Согласно исследованию геля, максимальное количество целевого белка получено в образцах AV2 (2-й час культивации) и AVurea extr., в образце AV0

14

(0-й час культивации) белка не обнаружено. Дорожка с AVpure prot. исчезла изза ошибки экспериментатора.

14.Построить зависимость длины пробега стандартных белков от логарифма их молекулярной массы:

Рисунок 6 – Зависимость длины пробега от логарифма MW

15.Пользуясь полученной калибровочной кривой определить молекулярную массу выделенных рекомбинантных белков:

Исходя из уравнения y = 0,0848x + 0,9397 была вычислена молекулярная масса выделенных белков:

Таблица 6 – Расстояние и молекулярные массы выделенных белков

Расстояние до линии финиша – 15,2 см. Известная молекулярная масса акворина – 22 кДа.

Вывод: для того, чтобы определить, в какой из собранных фракций находится целевой белок, необходимо разогнать все фракции на электрофорезе и сравнить с контролем, которым являются клеточные лизаты. В них наблюдается нарастание концентрации целевого белка в зависимости от времени индукции. В мочевинном экстракте акворина можно видеть

15

мажорный банд в том же месте, что и в клеточных лизатах после индукции (до индукции отсутствует). Все остальные банды присутствуют во всех образцах – это клеточные белки E. coli. Были измерены значения молекулярной массы белков. Можно сделать вывод о том, что полученные белки оказались близки по молекулярной массе к известной массе акворина, погрешность может быть связана с ошибками (пипетирования, измерения длины пути и т.д.). Максимально приближенное значение обнаружено в образце AV3, что может говорить о том, что к 3-му часу культивации было выделено наибольшее количество чистого апоакворина. Из-за отсутствия данных по образцу с чистым белком, невозможно точно сказать, был ли выделен целевой апобелок, однако, исходя из имеющихся данных, мы предполагаем, что это все-таки было сделано.

Полученное уравнение не совсем точно описывает исходную калибровочную кривую, отсюда отклонения в результатах. Если параметры ни одной стандартной функции не описывают полученную кривую, то можно убрать 1- 2 крайние точки и попытаться применить экстраполяцию снова, пока совпадение кривых не будет оптимальным.

16