1. Что такое генетическая трансформация? Какие способы трансформации бактериальных клеток существуют?

Генети́ческая трансформа́ция — изменение наследственных свойств клетки в результате внесения в нее генетической информации при помощи чужеродной изолированной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Трансформация приводит к появлению у трансформированной клетки (трансформанта) и ее потомства новых признаков, характерных для объекта — источника ДНК.

В 1928 году превращения непатогенных штаммов вирусов Streptococcus pneumoniae в патогенные штаммы, в результате взаимодействия с убитыми клетками патогенных штаммов. В 1944 году трансформацию обеспечивают молекулы ДНК, которые являются носителями наследственной информации.

2. Какими свойствами обладают компетентные клетки и для чего они используются?

Компетентная клетка – это те клетки, которые способны поглощать извне чужеродную ДНК. Например, состояние бактерии, при котором она может включать в себя экзогенные молекулы ДНК, т. е. быть реципиентом ДНК при трансфекции.

Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими свойствами:

• сниженным уровнем метаболизма;

• устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции;

• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;

• меньшими размерами;

•изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;

• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой

обработке;

• сниженным поверхностным зарядом.

Компетентные клетки широко используются в генной инженерии в качестве реципиентов векторных плазмид.

Клетки E. coli не обладают природной компетентностью. Однако ввиду важности этого организма для молекулярной генетики, были разработаны методы, придающие E. coli искусственную компетентность. В настоящее время установлено, что при низких температурах в присутствии двухвалентных катионов экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь клеток E. coli.

3. Опишите структуру экспрессионной плазмиды. За какие функции отвечает каждый из ее участков?

bla (Amp)- Селективный маркер (ген устойчивости к антибиотику ампициллину, данный ген обеспечивает негативную селекцию нетрансформированных клонов. Клетки, не содержащие плазмидную конструкцию, не способны расти на среде с ампициллином и погибают.)

ori- Ориджин репликации

araC – участок специальной генетической регуляции арабинозный оперон, позволяющий контролировать экспрессию флуоресцентного белка (присутствие арабинозы увеличивает экспрессию) – araC регуляторные

GFP – ген, кодирующий флуоресцентный белок

4. Что такое бактериальный оперон? Опишите структуру и принцип работы арабинозного оперона.

Оперон — это группа генов прокариот, находящихся под общим промотором. Все эти гены транскрибируются на одну общую молекулу мРНК.

В присутствии глюкозы – репрессора, оперон выключен. В присутствии арабинозы araC активирует транскрипцию оперона.

Гены araA, araB, araD структурные – кодируют синтез ферментов, образуют оперон araBAD. AraC кодирует регуляторный белок araC, имеющий центр связывания с арабинозой.

1. CAP (catabolism activating protein)-белок в комплексе с цАМФ связывается опероном в области промотора, активируя его экспрессию в случае нехватки глюкозы.

2. Регуляция белком araC.

Регуляторный белок araC, имеющий центр связывания с арабинозой. AraC осуществляет негативную и позитивную регуляцию.

В отсутствие арабинозы araC связывается с участками ДНК и образует петлю, препятствуя транскрипции. Связываясь с арабинозой, регуляторный белок становится активатором транскрипции araBAD-оперона.

По механизму «негативной регуляции»: Белок-репрессор соединяется с оператором и блокирует транскрипцию, так как препятствует перемещению РНК-полимеразы. Весь оперон оказывается «выключен».

При наличии в среде индуктора (арабинозы) он взаимодействует с белком-репрессором, в результате чего репрессор не может присоединиться к оператору. Свободный оператор «открывает путь» РНК-полимеразе, и все гены оперона транскрибируются. При удалении индуктора репрессор вновь занимает место на операторе, и транскрипция прекращается.