Большой практикум / Белки и ДНК / 1 Выделение и анализ плазмидной ДНК

Цель работы: знакомство с методами выделения ДНК, получение экспериментальных навыков выделения и анализа плазмидных ДНК.

Задачи: выделение плазмидной ДНК из кишечной палочки E. coli на примере экспрессионной плазмиды pUC18 или pET22b+, содержащего вставку чужеродного гена, оценка качества полученного препарата с помощью электрофореза в геле агарозы, определение концентрации ДНК.

Материалы и оборудование:

1.Термостатируемый шейкер-инкубатор Exella E-24, «New Brunswick» для выращивания клеточных культур;

2.Система документирования гелей «Bio-Rad» с трансиллюминатором;

3.Микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R с ротором для микропробирок 1,5-2 мл;

4.Источник постоянного тока и мини-камера для горизонтального гель-электрофореза с заливочным столиком «Bio-Rad»;

5.Микроволновая печь;

6.Наборы из трех автоматических пипеток на 2-20 мкл, на 20-200 мкл и на 100-1000 мкл «Gilson»;

7.Лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы Биосан;

8.Термостат модель KB53, «Binder»;

9.Мерные стаканы и колбы, одноразовые пластиковые пробирки и наконечники для пипеток;

10.Стационарная культура E. coli, содержащая рекомбинантную плазмиду;

11.Буферы и реагенты для выделения плазмидной ДНК;

a.Раствор №1 для выделения плазмидной ДНК;

b.Лизоцим сухой;

c.Раствор №2 лизирующий;

d.Раствор №3 нейтрализующий, 3М CH3COONa pH 4.75 (Ацетат Na);

e.Этанол 100% для осаждения ДНК;

f.Этанол 75% для промывания ДНК;

g.Раствор ТЕ для растворения ДНК;

h.Раствор фермента РНКаза А для расщепления РНК, 10 мг/мл;

12.Буферы и реагенты для проведения агарозного электрофореза;

a.TAEX50;

b.Бромистый этидий;

c.Краска для нанесения ДНК в гель;

d.Маркеры молекулярного веса DNA Ladder NEB: 1 kb and 100 bp.

Задача №1. Выделение плазмидной ДНК

Ход работы:

1.Культуру E. coli, содержащую рекомбинантную плазмиду, центрифугировать в 2 мл или 1,5 мл пробирках при 5000 rpm 3 мин. Культуральную среду вылить, осадок осушить;

2.Ресуспендировать осадок в 100 мкл раствора №1 (25 мМ Tris-HCl pH 8.0, 10 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы, РНКаза А) с лизоцимом (на кончике шпателя на 10 мл), инкубировать 5 мин при комнатной температуре;

3.Добавить 200 мкл свежеприготовленного лизирующего раствора №2 (0.2 М NaOH, 1% SDS). При приготовлении 10 мл раствора 1 мл 10% SDS и 200 мкл 10 М NaOH). Инкубировать с мягким перемешиванием с перевертыванием пробирки до полной прозрачности, но не более 5 мин (важно!);

2

4.Добавить 200 мкл 3 М NaOAc pH 4.75 для нейтрализации (раствор №3), смешать переворачиванием и инкубировать не более 5 мин, периодически помешивая;

5.Центрифугировать на максимальных оборотах 2 мин (16000 rpm), потом перемешать переворачиванием и продолжить центрифугирование еще 6 мин;

6.Приготовить чистую пробирку с 1 мл 100% этанола. Весь супернатант осторожно, не разрушая белковый осадок, прилить к 1 мл этанола, перемешать на вортексе и центрифугировать 5 минут на максимальных оборотах. Старую пробирку с белковым осадком выбросить. После центрифугирования образуется белесый осадок, содержащий плазмидную ДНК и остатки РНК. Супернатант от осадка нуклеиновых кислот вылить;

7.К осадку нуклеиновых кислот прилить 1 мл 70% этанола для промывки осадка от солей, перемешать на вортексе, затем центрифугировать 2 минуты на максимальных оборотах. Большая часть осадка, скорее всего, останется прилипшей на стенке пробирки;

8.Супернатант вылить, остаток спирта удалить пипеткой, осадок осушить на воздухе 10 мин и растворить в 80 мкл ТЕ (10 мМ Tris-HCl pH 8.0, 1 мМ EDTA).

Задача №2. Анализ полученных препаратов плазмидных ДНК с помощью горизонтального электрофореза в геле агарозы

Ход работы:

1.Приготовить буфер 250 мл TAE (40 мМ Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, pH 8.0) для электрофореза разведением стокового раствора TAEX50;

2.Приготовить 1% гель агарозы на ТАЕ-буфере;

a.Для 100 мл геля взять 100 мл H2O, добавить 2 мл TAEx50 и высыпать в буфер навеску 1 г агарозы. Навеску взвешиваем, насыпая агарозу через край в пластиковую плашку для взвешивания;

b.Расплавить агарозу в микроволновой печи (~2 раза по 30 сек с интенсивным перемешиванием между). Проконтролировать визуально однородность расплава;

c.После остывания до умеренно горячего состояния (едва терпит рука) добавить бромистый этидий до 0,025 мкг/мл (2,5 мкл бромистого этидия на 100 мл расплава геля);

d.Залить гель в форму до толщины ~5 мм. Для этого выровнять заливочный столик с помощью уровня, зажать между резиновыми стенками подложку для геля, вставить гребенку для формирования лунок в геле. Подождать до полной полимеризации 20 мин;

e.Вынуть гель вместе с подложкой и гребенкой и вставить все в прибор для электрофореза. Налить в прибор приготовленный TAE буфер так, чтобы он был выше геля на 2-3 мм;

f.Придерживая подложку вниз, вытащить гребенку строго вверх, не перекашивая по сторонам;

3.В объеме не менее 15 мкл нанести 1 и 4 мкл полученного препарата рядом с 500 нг маркерной ДНК (например, 2 мкл 1 kb DNA Ladder NEB) в лунки приготовленного 1% геля агарозы. Образцы перед нанесением смешивают с 1 мкл буфера для нанесения и электрофорезным буфером так, чтобы наносимый объем составил 10-15 мкл, для равномерного распределения ДНК по толщине геля;

4.Провести электрофорез в течение 40 мин при напряжении 100 В;

5.С помощью системы видеодокументации получить фотографию геля в проходящем УФ-свете при длине волны 260 нм, для чего:

a.Включить компьютер и 2 кабеля системы видеодокументирования Gel Doc X фирмы «BioRad»;

b.Запустить программу Quantity One 4.5_6, открыть в ней в раскрывающемся меню Gel Doc X. Инструкция по использованию находится в папке прибора;

c.Сделать скан геля согласно указаниям. После открывания скана геля сохранить его в формате

JPG;

3

Рисунок 2 – График аппроксимации зависимости молекулярного веса от пройденного пути

На треках 1 и 2 с препаратом плазмидной ДНК расположено по 2 бэнда. Верхние бэнды содержат более длинные молекулы ДНК, и их свечение более интенсивно, чем свечение нижних. По всей видимости, первый бэнд на обоих треках представляет собой релаксированную форму плазмидной ДНК (open circular), а второй – суперскрученную (covalently closed circle).

Оценка суммарного количества плазмидной ДНК во внесенной в гель пробе путем сопоставления интенсивности свечения пробы и стандартов проводилось при помощи программы ImageJ. По полученным значениям интенсивности свечения был построен калибровочный график с помощью заведомо известных количеств стандартных образцов. Интенсивность свечения маркера с массой 125 нг (Mw=3kb) принималась за 1,0.

Таблица 2 – Отношение массы к интенсивности свечения

Стандарты

5

По результатам расчетов суммарное количество плазмидной ДНК было внесено

a)на дорожку с 1 мкл образца в количестве 26,7 нг;

b)на дорожку с 4 мкл образца в количестве 210,7 нг.

Впересчете на объем препарата концентрация ДНК составляет

a)в образце с 1-й дорожки 26,7 нг/мкл;

b)в образце со 2-й дорожки 52,7 нг/мкл.

Расхождение можно объяснить неточностью кривой аппроксимации и измерения интенсивности свечения.

Вывод: было проведено выделение и последующий анализ плазмидной ДНК. В результате анализа были получены следующие результаты:

1.Анализируемый препарат плазмидной ДНК, по всей видимости, представляет собой смесь двух форм плазмидной ДНК – релаксированной (oc) и суперскрученной (ccc);

2.Молекулярный вес исследуемых образцов составил 10,63 и 8,07 килобаз (1- й трек, 1-й и 2-й бэнд), 10,04 и 7,63 килобаз (2-й трек). Вероятно, первый бэнд на обеих дорожках соотвествует димерной форме плазмидной ДНК (за счет их большего размера);

3.Суммарное количество внесенной в гель плазмидной ДНК составило 26,7 нг на первый трек, и 210,7 нг на второй. В пересчете на общий объем внесенного препарата, концентрация ДНК в образце с 1-й дорожки составила 26,7 нг/мкл, со 2-й – 52,7 нг/мкл.

6