Большой практикум / Белки и ДНК / 2 Рестрикционный анализ ДНК

Цель работы: знакомство с методами рестрикционного анализа ДНК, получение экспериментальных навыков рестрикционного анализа плазмидных ДНК и составления рестрикционных карт.

Задачи: постановка реакции рестрикции плазмидной ДНК, оценка качества проведенной реакции с помощью электрофореза в 1% геле агарозы, определение длин полученных рестрикционных фрагментов, их сопоставление с рестрикционной картой анализируемой плазмиды.

Материалы и оборудование:

1.Система документирования гелей «Bio-Rad» с трансиллюминатором;

2.Микроцентрифуга для пробирок «Eppendorf» 5417R с ротором для микропробирок 1,5-2 мл;

3.Источник постоянного тока и мини-камера для горизонтального гель-электрофореза с заливочным столиком «Bio-Rad»;

4.Микроволновая печь;

5.Наборы из трех автоматических пипеток на 2-20 мкл, на 20-200 мкл и на 100-1000 мкл «Gilson»;

6.Лабораторный шейкер-вортекс «Вортекс V-1» фирмы Биосан;

7.Термостат модель KB53, «Binder»;

8.Мерные стаканы и колбы, одноразовые пластиковые пробирки и наконечники для пипеток;

9.Буферы и реагенты для проведения агарозного электрофореза;

Задача №1. Выделение плазмидной ДНК

Ход работы:

1.На основании физической карты плазмиды выбрать три рестриктазы для проведения расщепления полученного препарата плазмидной ДНК в двух вариантах реакции гидролиза двумя рестриктазами одновременно;

2.Для каждого из вариантов из каталога фирмы поставщика (Сибэнзим, NEB) выбрать состав реакционной смеси, в которой одновременно активны обе из используемых рестриктаз;

3.По данным определения содержания ДНК в полученном препарате выбрать объемы пробы для рестрикционного анализа. Определить необходимое количество единиц активности рестриктазы для полного гидролиза полученного препарата за 30 мин, и, в соответствии с этим, добавляемый объем фермента. Записать состав реакционной смеси;

4.Собрать реакции в двух вариантах и инкубировать 30 мин при оптимальной температуре расщепления для конкретных ферментов. В качестве отрицательного контроля ставится проба ДНК без добавления ферментов – всего 3 микропробирки;

5.Провести электрофорез гидролизованных образцов в 1% геле агарозы вместе с маркерными ДНК;

6.Оценить полноту расщепления пробы и размер полученных рестрикционных фрагментов. Сопоставить полученный размер с ожидаемым согласно физической карте плазмиды. Записать выводы.

Задание:

Для рестрикционного анализа взять одну плазмиду из двух: A или B (концентрация 500 нг/мкл). Поставить реакцию расщепления двумя рестриктазами NcoI и XhoI в общем объеме 20 мкл с 500 нг ДНК и минимальным количеством добавленных рестриктаз. После проведения электрофореза нужно определить, содержит ли ваша плазмида вставку по сайтам KpnI/NcoI-XhoI и

2

какого она размера. Для чего нужно определить размер полученных фрагментов путем сравнения с маркерами молекулярного веса и построить рестрикционную карту по сайтам расщепления на основе выше приведенной карты.

Анализ полученных результатов:

Для проведения реакции рестрикции были использованы следующие рестриктазы:

1. Sfr274 I (прототип Xho I), Сибэнзим.

SE-буфер B (100%), G (75-100%); 50°C

5’..C^TCGAG..3’

3’..GAGCT^C..5’

2. NcoI, NEB.

Буфер NEB 2.1; 37°C 5’..C^CATGG..3’ 3’..GGTAC^C..5’

Для проведения реакции был выбран следующий состав реакционной смеси, в которой одновременно активны обе рестриктазы:

NEB 2x10 (SE-буфер G): 10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM DTT.

Реакция рестрикции была проведена на образце плазмидной ДНК без вставки рекомбинантной ДНК (образец B), и использовся следующий состав реакционной смеси:

V = 20 µl, pDNA = 500 ng

Был проведен электрофорез в 1% агарозном геле, получена электрофореграмма, построены калибровочные графики на основе маркеров длин ДНК:

3

Рисунок 1 – Электрофорез

Для 1kbp ladder калибровочная кривая по уравнению

y = -0,186ln(x) + 1,9664,

для 100bp ladder по уравнению

y = -0,146ln(x) + 1,7122.

Используя карту плазмиды (B) был определен размер ожидаемых фрагментов:

0 CMV

Amp

NcoI (922)

376 bp

Neo

975 bp

735 bp

NcoI (2696)

Рисунок 2 – Рестрикционная карта (модификация без вставки). Стрелками указаны сайты рестрикции, цифрами внутри размеры фрагментов

4

Экспериментально полученная длина плазмидных фрагментов (логарифмическая аппроксимация) была сравнена с расчетной длиной согласно карте плазмиды:

Таблица 1 – Предполагаемые длины фрагментов после реакции рестрикции

Вывод:

В ходе работы мы провели рестрикционный анализ, получили навык работы с рестрикционными картами.

На форезе мы получили 4 бэнда, относящиеся к плазмиде, подверженной рестрикции. Теоретический расчет и экспериментальные результаты сходятся, что говорит о правильности проведения реакции рестрикции и точности расчетов. Число бэндов зависит от количества фрагментов. В данном случае в плазмиде не было вставки чужеродного гена (т.к. это образец B, а вставка была в образце A, у которого 5 бэндов – 5 фрагментов).

По результатам рестрикционного анализа строятся генетические карты (обычно с использованием нескольких рестриктаз), таким образом можно идентифицировать биологически значимые участки ДНК (для определения мутаций, идентификации организма, а также для определения генной модификации).

5