Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Скачиваний:
96
Добавлен:
08.05.2021
Размер:
49.66 Кб
Скачать

Иммунотоксичность бионаноматериалов

Водные вытяжки образцов бионаноматериалов получают, выдерживая полимер (порошок, пленки или волокна) в соотношение единицы площади к единице объема бидистиллированной воды (1 см : 1 мл) или единицы массы к единице объема воды (1мг:1мл). Используют два режима приготовления вытяжек: однократную экспозицию материала в воде в течение 3 сут при 37 0С и динамический режим, в ходе которого через 3 сут первые партии вытяжек сливают, образцы материалов заливают новой порцией воды, которую сливают через 7 сут; образцы снова заливают бидистиллированной водой на 10 сут. При этом бидистиллированная вода, термостатируемая в аналогичных условиях, служит контролем.

Исследование общетоксического действия бионаноматериалов проводят в так называемом «остром» опыте на белых мышах линии Balb/c. Используют половозрелых самцов с исходной массой тела 21-23 г. Число животных в опыте - 28, по 7 голов в каждой группе: 1 группа – интактный контроль, 2 - положительный контроль (внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл физиологического раствора); 3 и 4 группы - по 0.5 мл вытяжек, соответственно, материала 1 и материала 2 (возможно 3, 4,5, …). Время наблюдения – 7 сут. В ходе опыта оценивают общее самочувствие и поведение животных, а также массу тела, вес всех внутренних органов и морфологию периферической крови после выведения животных.

В конце эксперимента регистрируют иммунотоксический эффект по фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов.

Иммунотоксичность оценивают по фагоцитарной активности макрофагов лабораторных мышей (или белых крыс). Исследуемые вытяжки (по 0.5 мл) вводят животным внутрибрюшинно. Животных кормят и наблюдают в течение 7 суток. Сразу после забоя животных брюшину асептически освобождают и внутрибрюшинно вводят 5 мл среды 199, содержащей 20 % ЭТС. После массажа брюшной полости (для по­лучения большего количества перитонеальных клеток) введенную среду откачивают шприцом. Порции клеточной суспензии, полученные от 5-ти животных, объединяют в общий пул – 1 пул на 1 материал. Концентрацию живых клеток доводят до 1,5х10 кл/мл. Суспензию клеток стерильно разливают по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. После 2 ч. инкубации при 37 °С суспензию клеток в чашках Петри отмывают средой 199, вводят краситель с последующей инкубацией проб в течение 60 мин. После отмывки средой 199 в чашки Петри добавляют по 3 мл лизирующего раствора для ли­зиса макрофагов, поглотивших краситель. Степень поглощения красителя макрофагами опытной группы оценивают по оптической плотности лизирующего раствора, в сравнение с фагоцитарной активностью в положительном контроле (внутрибрюшинная жидкость животных после введения физиологического раствора). При отсутствии иммунотоксичности материала плотность лизи­рующего раствора в эксперименте не должна достоверно отличаться от показателя в контроле.

Пример результатов

Внешних проявлений интоксикации у животных после введения вытяжек в течение наблюдаемого периода не выявлено. Они активно поедали корм, хорошо росли, шерстистый покров был чистым и гладким. Поведение мышей в опыте не отличалось от контрольных групп. Отклонений в массе тела, а также массе внутренних органов у подопытных животных относительно контроля не зафиксировано (таблица 1). Макроскопические исследования внутренних органов животных через 7 дней от начала эксперимента не выявили каких-либо патологических изменений.

Анализ морфологического состава периферической крови мышей в контрольных и опытных группах показал, что колебания концентрации количества эритроцитов и лейкоцитов и других клеток находилось в пределах физиологических величин. Сдвигов в лейкоцитарной формуле крови животных, получивших вытяжки полимеров, также не выявлено (таблица 2).

В конце эксперимента перед забоем животных определена иммунотоксичность материалов по фагоцитарной активности макрофагов. Фагоцитарная активность макрофагов перитонеальной жидкости испытуемых животных во всех экспериментальных группах в пределах выбранной достоверности резуль­татов измерений (2 ) была сопоставима с контролем (таблица 3), что свидетельствует об отсутствии иммунотоксического эффекта со стороны материала 1 и материала 2 .

Таблица 1

Показатели общетоксического действия вытяжек материалов 1 и 2

в опыте на белых мышах (М*±m)

Показатель

1 группа

интактный контроль

2 группа

положитель-ный контроль

3 группа

материал 1

4 группа

материал 2

Масса тела (г):

исходная

конец опыта

Масса органов (г):

печень

селезенка

почки

легкие

сердце

21.20±0.14*

24.10±0.32

1.19±0.04

0.15±0.01

0.33±0.02

0.20±0.02

0.15±0.00

22.24±0.13

25.07±0.45

1.20±0.03

0.14±0.01

0.34±0.01

0.20±0.02

0.16±0.01

23.54±0.20***

26.33±0.36

1.24±0.05

0.15±0.00

0.34±0.03

0.21±0.02

0.14±0.00

23.60±0.19***

26.10±0.39

1.21±0.04

0.15±0.01

0.35±0.02

0.21±0.02

0.17±0.01**

*-достоверное отличие между 1 и 2 группами (0.99); ** -достоверное отличие между 3 и 4 группами; ***-достоверное отличие 3 и 4 групп от 2

Таблица 2

Морфология периферической крови мышей на 7 день после введения вытяжек

(М* ± m)

Показатель

1 группа

(интактный контроль)

2 группа-

(положитель-ный контроль)

3 группа

материал 1

4 группа

материал 2

Эритроциты,109/мл

Лейкоциты, 109/мл

палочкоядерные, %

сегментоядерные,%

лимфоциты, %

моноциты, %

8.05±0.03

7.65±0.06

2.50±0.52

48.00±2.30

40.50±2.42

9.00±0.67

7.99±0.04

7.57±0.08

3.57±0.48

54.00±2.14

39.43±1.95

7.86±0.80

8.00±0.03

7.57±0.06

4.00±0.69**

46.71±2.52

41.43±2.53

7.86±0.46

7.99±0.04

7.67±0.07

6.71±0.58***

49.00±2.28

37.62±2.34

6.72±0.71

** -достоверное отличие между 3 и 4 группами (0.99); ***-достоверное отличие 3 и 4 групп от 2

Таблица 3

Оптическая плотность раствора с лизированными перитониальными

макрофагами мышей в эксперименте (Dопыт) относительно контроля (Dконтр.)

Наименование образцов

Dопыт/Dконтр

3 группа

материал 1

6.8±1.1/7.1±0.8

4 группа

материал 2

6.9±0.8/7.1±0.7