Биохимические методы исследования в медицине

Определение белка крови методом спектрофотометрическим методом

Спектрофотометрические методы определения общего белка сыворотки крови основаны на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области. Растворы белка обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм. Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Точность и специфичность методов определения белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями. В связи с этим величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается при концентрации белка в сыворотке до 120 г/л.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ

Чтобы узнать верный ответ, сверните прямоугольник!

Задача № 1

Врач-лаборант проводил исследования с применением метода тонкослойной хроматографии. Он нанес на линию старта пробы, поставил пластинку в хроматографическую ванну, начал хроматографию. Тут он сообразил, что забыл нанести растворы свидетелей.

Варианты действий для исправления оплошности

1. Достать пластинку и нанести капли растворов – свидетелей и продолжить исследование.

21

2.Дождаться окончания хроматографии. Взять новую пластинкуи нанести на нее растворы свидетелей, провести опыт с этими растворами. Сравнить показатели (зоны распределения) на обоих пластинках 3. Прекратить хроматографию, взять новую пластинку и нанести на нее исследуемые растворы и растворы свидетелей.

Какие дальнейшие действия являются верными ?Дайте объяснения.

Ответ. Единственное правильное действие вариант № 3.

Вварианте №1 растворитель и свидетели пройдут разные «пути», кроме того нарушится равновесие в системе за счет испарения растворителя с пластинки.

Вварианте № 2 - сравнение длины «пробега» пятен на разныхпластинках может быть ошибочным из-за различия свойст пластинок и несоблюдения условий проведения опыта.

Задача № 2

Педиатр назначил провести исследование мочи у ребенка, которому поставлен предварительный диагноз: «болезнь кленового сиропа» - генетический дефект, связанный с обменом валина, лейцина, изолейцина. Вышеназванные кислоты выделяются с мочой в увеличенном количестве, поскольку нарушен путь их участия в метаболических процессах.

Вопросы.

1.Какие известные методы можно использовать для проведения исследования - центрифугирование, хроматография, иммуноферментный анализ?

2.Какие дополнительные данные привлечет врач – лаборант во время и после проведения исследовани?

3.Важно ли в этом случае проведение количественного исследования, или достаточно только качественного?

Ответ.

1.Можно применить все варианты хроматографического исследования: бумажную, тонкослойную и газожидкостную хроматографию. Наиболее эффективна ГЖХ.

2. В случае тонкослойной или бумажной хроматографии надо использовать свидетели и привлечь дополнительные данные –величины Rf вышеназванных кислот (табл. 1).

3. Следует использовать количественное исследование, поскольку в норме в моче есть небольшое количество аминокислот, и надо подтвердить. что их выделение значительно увеличилось. Метод ГЖХ позволяет одновременно провести качественное и количественное исследование (площади пиков

22

пропорциональны содержанию). Если проведена градуировка, можно рассчитать концентрацию.

Задача № 3.

В образце биологической жидкости определяют содержание мочевины. После добавления реактива и нагревания смеси на кипящей воляной бане раствор стал розово - красного цвета. Содержание мочевины в биологической жидкости в норме изменяется от 3 до 8 ммоль/л, но может развиваться значительное увеличение. К набору прилагаются 3 стандартных раствора: 2 ммоль/л, 6 ммоль/л, 12 ммоль/л. Считается, что для уменьшения ошибки измерения концентрация стандарта не должна очень сильно отличаться от ожидаемого результата.

Вопросы.

1.Можно ли для проведения эксперимента использовать фотоэлектроколориметр (ФЭК) ?

2. Какую длину волны (цвет светофильтра) следует выбрать? 3.Какой стандартный раствор следует выбрать?

4.Какие функции несет стандартный раствор?

Ответы

1.В процессе проведения исследования образуется окрашенный раствор, это означает, что длины волн находятся в видимой части спектра, для которой приспособлена оптическая система ФЭКа.

2.Раствор розово-красный, соответствует участок спектра 625 -740 нм. Надо выбрать светофильтр дополнительного цвета - зеленого, длина волны

520-560 нм.

3.Поскольку указано, что может развиваться значительное увеличение, выше 8 ммоль/л. , лучше выбрать стандартный раствор 12 ммоль/л.

4.Без стандартного раствора нельзя провести количественное определение, т.е. концентрацию вещества в исследуемом растворе. Знание концентрации стандартного раствора позволяет получить величину плотности стандартного раствора и использовать для расчета концентрации определяемого раствора формулу ( закон Ламберта –Бера).

Задача № 4

Проведен анализ сыворотки крови на содержание белка у пациента до начала лечения (№1) и после проведения курса терапии (№2) . В таблице приведены результаты исследования образцов сыворотки крови и стандартного раствора с концентрацией белка 80г/л. Содержание белка колеблется от 70 до 90 г/л.

1.Правильно ли в отношении концентрации выбран контрольный раствор? 2. В какой области спектра (видимой, УФ) следует проводить измерения? 3.Укажите выбранную длину волны, какие связи имеют такую частоту поглощения ?

4.Запишите формулу для расчета концентрации исследуемых образцов и полученные результаты в таблицу.

5.Выскажите мнение, можно ли считать результат лечения успешным?

Ответ.

1.Контрольный раствор выбран верно, поскольку содержание 80г/л находится в пределах референтной нормы и до концентрации 120 г/ л сохраняется линейная зависимость «плотностьраствораконцентрация», т.е. закон ЛамбертаБера.

2.Измерения проводят в УФ-области спектра, поскольку белок - вещество бесцветное.

3.Следует выбрать длину волны при 220 –225 нм, поглощение обусловлено пептидными связями. 4. Формула для расчетеа

Соп = С контр. D оп /D контр.

С№1 =42,7 г/л С №2 =74, 7 г/л

4.Уровень белка повысился после лечения и соответствует референтным значениям.

24

Литература

1.Зеленин К. Н. Газовая хроматография в медицине .Режим доступа:URL: http://window.edu.ru/catalog/pdf2txt/323/21323/4536

2 Мето ды кли ни че ских лабо ра тор ных иссле до ва ний / под ред. проф.

В.С.Ка мыш ни ко ва. – 8- е изд. – М. : МЕДпресс-ин форм, 2016. – 736 с

3.Пассет Б. В., Антипов М. А. - Практикум по техническому анализу и контролю в производстве химико-фармацевтических препаратов и антибиотиков. - М.: Медицина, 1981, 272 с., ил.

4 Шлейкин А.Г. Лабораторный практикум: Часть 1. Методические основы и правила работы в лаборатории биохимии: Учеб. пособие. – СПб.: Университет ИТМО;

ИХиБТ, 2015. – 70 с. Режим доступа: URL: http://www.chemastu.ru/chair/study/PCMA/r3_1.htm

5Режим доступа URL:: https://yandex.ru/images/search?img_url=http%3A%2F%2Fimages.myshared.ru%2F4%2F31

6Режим доступа URL https://yandex.ru/images/search?img_url=http%3A%2F%2Fimages.myshared.ru%2F4%2F31

25