11. Лабораторная диагностика тб. Молекулярно-генетические методы (GeneXpert, tb-Lamp, проба на стрипах

Молекулярно-генетические методы позволяют обнаружить ДНК микобактерий туберкулезного комплекса в исследуемом образце (мокроты) и определить наличие/отсутствие устойчивости к рифампицину и изониазиду со специфичностью 95%.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это амплификация специфических последовательностей нуклеиновых кислот, с помощью которой в течение нескольких часов можно размножить нужную последовательность в миллионы раз.

Тест - система «GeneXpert» - ЗОЛОТОЙ СТАНДАРТ - автоматизирования система ПЦР - диагностики туберкулеза. Позволяет обнаружить ДНК микобактерии туберкулеза и определить наличие гена устойчивости к рифампицину в течении 2-х часов. Необх. конц МБТ 1000/мл. Метод дорогостоящий, но на сегодняшний день самый быстрый по срокам определения лекарственной устойчивости МБТ.

Принцип метода состоит в увеличении в 106—108 раз числа копий специфического участка ДНК МБТ, катализируемого in vitro рнк-полимеразой в автоматическом режиме

Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликоны) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе

-Метод обладает высокой чувствительностью – он позволяет обнаруживать возбудитель при содержании всего нескольких сотен микроорганизмов в 1 мл исследуемого материала (мокроты, крови, плеврального выпота и т.д.)

-Результат исследования можно получить в течение 5–6 ч.

-Этот высокочувствительный метод в ряде случаев может давать ложноположительные результаты, что ограничивает достоверность исследования

Петлевая изотермическая амплификация (LAMP) является новым методом амплификации нук­леиновых кислот. Сущность данного метода заключается в удвоении участка ДНК с высокой специфичностью, эффективностью и скоростью в условиях постоянной температуры. Позволяет проводить типизацию МБТ, МЛУ/нет.

+быстро, дёшево и с минимумом технических средств, амплификация (умножение) ДНК при использовании этой технологии происходит в одной пробирке. 

– не обнаруживает устойчивость бактерий туберкулёза к препаратам. 

ДНК-стрипы (Hain-test) - GenoType

Метод основан на множественной обратной гибридизации на ДНК-стрипах и лежит в основе тест-системы GenoType MTBDRplus, применяемой для определения ЛЧ к изониазиду и рифампицину, и тест-системы GenoType MTBDRsl для определения ЛУ к фторхинолонам, аминогликозидам/циклическим пептидам и этамбутолу.

После одноэтапной амплификации со специфическими праймерами продукты ПЦР гибридизуются с олигонуклеотидами, иммобилизованными на стрипах. Гибридизация ампликонов проходит в открытых ванночках, что увеличивает риск контаминации.

Результат гибридизации визуализируется на нейлоновой мембране – стрипе в виде набора полос, которые вручную или с помощью прибора сравнивают с шаблоном и определяют наличие мутаций, ассоциированных с ЛУ

-возможность идентифицировать вид МБ, Рез-т 5 дней.

DNA-STRIP технология

Принцип метода: На ДНК-стрипы нанесены специфические пробы, которые комплементарны амплифицируемым нуклеиновым кислотам (ампликонам). После денатурации одноцепочечные ампликоны специфически связываются с пробами на стрипах (гибридизация) и затем визуализируются в последовательной энзиматической реакции (со стрептавидином и щелочной фосфатазой).