10. Лабораторная диагностика тб. Культивирование на плотных и жидких питательных средах.

Показания: выявление МБТ в исследуемом материале и определение лек.чув-ти для подтверждения ТБ

Посев биологического материала на плотную среду Левенштейна-Йенсена (яичная среда)

Подготовка материала к посеву:

1)деконтаминация – освобождение материала от сопутствующей гноеродной и гнилостной микрофлоры (3% серной кислотой, 4% раствором едкого натрия, 5% щавелевой кислотой);

2)разжижение и гомогенизация – придание материалу гомогенной консистенции

МБТ дают рост через 3-6 недель (иногда на 60-90 день). Оптимальная температура для культивирования - 37-38с, рН – 6,4-7,2, с хорошим доступом воздуха, но могут развиваться и в анаэробных условиях. Инкубацию проводят в течение 12 недель. растут в виде светло-кремового морщинистого или чешуйчатого суховатого налета, запах культур ароматический, очень характерный. При росте на плотных питательных средах различают 2 типа колоний:

R – колонии - имеют различную величину и вид, чаще округлые образования желтоватого или слегка кремового оттенка (цвет слоновой кости), с шероховатой сухой поверхностью, напоминающей манную крупу или цветную капусту.

S – колонии– округлые, влажные, иногда с розовато-желтой пигментацией. Часто такие колонии растут при посеве материала от больного после курса химиотерапии.

Интенсивность роста

(+) — 1— 20 КОЕ — "скудное" бактериовыделение;

(++) — 21—100 КОЕ — "умеренное" бактериовыделение;

(+++) — > 100 КОЕ — "обильное" бактериовыделение.

Оценку и учет результатов посева производят по следующим критериям:

- появление роста колоний на средах не ранее 3-4 недель инкубации

-срок появления роста, начиная со дня посева

-интенсивность роста

-наличие колоний характерной морфология и окраски

-микроскопическое подтверждение КУМ при окраске по Ц-Н

-загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами

- отсутствие роста

Преимущества:

-Необх концентрация – 10-100/мл, возможность ориентировочно идентифицировать МТК,

-низкая стоимость (яичный желток)

-Диагностическая чувствительность культурального метода достигает 70-80% среди впервые выявленных больных ТБ легких.

-специфичность превышает таковую микроскопических методов, а предел обнаружения значительно выше: он позволяет выявить МБ при наличии в 1 мл исследуемого диагностического материала нескольких сотен и даже десятков жизнеспособных микроорганизмов.

-С помощью культурального метода удается выявить на 20-40% больше случаев ТБ с  бактериовыделением по  сравнению с  методом микроскопии среди впервые выявленных больных.

Недостатки:

- являются достаточно трудоемкими и  требуют значительных капиталовложений, наличия помещений и  материально-технической базы для приготовления питательных сред, обработки образцов и  культивирования микроорганизмов, специализированного лабораторного оборудования и  надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность. Кроме того, культуральная диагностика требует специализированного обучения персонала.

Медленный рост МБТ требует значительного времени ожидания результатов исследования. В среднем при посеве диагностического материала от впервые выявленных больных для получения результатов на плотных средах требуется 21-36 дней, на жидких средах – 12-22 дня.

Культивирование на жидкой питательной среде Миддлбрука 7Н9 в автоматизированной системе ВАСТЕС-960

Радиометрический метод быстрого определения роста МБТ, путем определения уровня меченного СО _2 . Микобактерии культивируют в жидкой синтетической питательной среде Миддлбрук 7Н9, где в качестве источника углерода используется радиоактивная меченая С₁₄ пальмитиновая кислота. При размножении МБТ утилизируют С₁₄ и выделяют радиоактивный углекислый газ С₁₄О₂. В аппарате имеется флуоресцентный сенсор, обеспечивающий индикацию роста. В процессе развития МБТ в питательной среде снижается концентрация кислорода, что приводит к увеличению степени флуоресценции индикатора. Ярко-оранжевая окраска, появляющаяся при освещении пробирок ультрафиолетом, свидетельствует о положительном результате посева.

Преимущества

- высокая чувствительность и специфичность

- Наличие роста может быть зарегистрировано начиная с 4-5 суток от момента посева. При положительных данных бактериоскопического исследования рост МБТ регистрируют достоверно на 7-10-й день и на 14-21-й дни при отрицательных данных.

-Культивирование на  жидкой среде повышает выявление МБ примерно на 10% по сравнению с ППС.

- Преимущества BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями над  ППС обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и  сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований.

Недостатки

- высокая себестоимость исследования;

- необходимость применения радиоактивных изотопов и специального радиометрического оборудования, сложность работы с изотопной технологией;

- необходимость дополнительного посева на плотную питательную среду при возникновении проблем с идентификацией или интерпретацией результатов.

-Невозможность наблюдения структуры и окрашивания колонии в жидкой среде.

-Если в процессе деконтаминации и ингибирования добавкой PANTA остается хотя бы одна живая контаминирующая бактерия, она может вызвать заражение всей среды. Контаминация может скрыть рост микобактерий.

-Положительную культуру из клинической пробы невозможно соотнести с колониеобразующими единицами (КОЕ), присутствующими в пробе - иногда это используется для определения важной нетуберкулезной инфекции.

-Пробирка MGIT, кажущаяся положительной, может содержать смесь культур более одного вида микобактерий.