4433

21

бромина

Материал исследования: чай черный или зеленый.

Реактивы и оборудование

1.5% раствор HCl.

2.Раствор йода и йодиде калия (реактив Вагнера-Бушарда – 5 г йода и 10 г йодида калия растворить в 100 мл воды, можно воспользоваться раствором Люголя, который необходимо развести в 2 раза).

3.10% свежеприготовленный раствор танина.

4.1% раствор пикриновой кислоты.

5.30% раствор азотной кислоты.

6.10% раствор аммиака.

7.Штатив с пробирками.

8.Пипетки.

9.Песчаная баня или спиртовка.

10.Выпарительная чашка.

Экспериментальная часть

Ход работы:

1 г черного или зеленого чая поместить в пробирку, залить 10 мл 5% раствора соляной кислоты и кипятить на спиртовке или песчаной бане в течение 5 минут, считая от момента закипания. Слить экстракт с осадка в другую пробирку и остудить.

22

Для проведения осадительных реакций в три пробирки налить по 1 мл приготовленного экстракта, в первую пробирку добавить 1 мл раствора йода в йодиде калия, во вторую – 1 мл раствора танина, в третью – 1 мл раствора пикриновой кислоты. Отметить цвет образующихся осадков.

Для проведения мурексидной пробы остаток экстракта перелить в выпарительную чашку, добавить 10 капель азотной кислоты и выпарить на песчаной бане досуха. Остаток смочить 1-2 каплями раствора аммиака и описать наблюдаемое изменение остатка.

Указания к составлению отчета: Написать формулы алкалоидов чайного листа, реакции идентификации, отметить цвета осадков.

Лабораторная работа № 5 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ УГЛЕВОДОВ В

РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОМАССЕ

Цель работы:

закрепить знания по теме «Углеводы» и овладеть методами количественного определения содержания углеводов в растительном сырье.

В различных сортах яблок содержится от 600 до 14800 мг% углеводов с преобладанием отдельных моносахаридов, а также сахарозы.

Исследуемый материал: яблоки нескольких сортов.

Реактивы и оборудование

1.0,1 н раствор йода.

2.0,1 н раствор натрия гидроксида.

3.10% раствор серной кислоты.

4.0,1 н раствор натрия тиосульфата.

5.1% раствор крахмала.

6.10% раствор соляной кислоты.

7.Сода

8.Плоскодонные колбы на 50 мл.

9.Водяная баня с термометром.

23

10.Воронки.

11.Фильтры бумажные.

12.Мерные колбы на 100 мл.

13.Пипетка на 5 мл.

14.Индикаторная бумага.

15.Мерные колбы на 50 мл.

Экспериментальная часть

Ход работы: Берут навеску 5 г одного из сортов яблок, прибавляют 50 мл дистиллированной воды и экстрагируют на водяной бане при температуре 70ОС в течение 30 минут. Температуру бани не доводят до 100ОС, чтобы избежать гидролиза сахарозы, который может идти под влиянием имеющихся в яблоках кислот. По истечении времени нагревания, вытяжку отфильтровывают через складчатый фильтр в мерную колбу на 100 мл. Остаток на фильтре несколько раз промывают горячей водой. Охлажденную до комнатной температуры вытяжку с промывными водами доводят водой до метки. Отбирают пипеткой 5 мл вытяжки и определяют в ней содержание глюкозы по Вильштеттеру. Метод определения основан на окислении альдегидной группы глюкозы йодом до карбоксильной группы в присутствии фруктозы и сахарозы, которые остаются неизменными.

Для определения глюкозы по Вильштеттеру к 5 мл исследуемого раствора прибавляют 7 мл 0,1 н раствора йода. Через 2-3 минуты при энергичном перемешивании медленно добавляют 10 мл 0,1 н раствора натрия гидроксида и оставляют стоять на 20 минут. После этого раствор подкисляют 10% раствором серной кислоты до кислой рН и остаток йода титруют 0,1 н раствором натрия тиосульфата в присутствии индикатора – раствора крахмала.

24

Далее 25 мл вытяжки из яблок помещают в коническую колбу, прибавляют 2 мл 10% соляной кислоты и смесь выдерживают на кипящей водяной бане в течение 30 мин, затем раствор охлаждают, доводят до нейтральной рН с помощью соды, переливают в мерную колбу на 50 мл и доводят водой до метки. Далее снова определяют глюкозу по методу Вильштеттера. В этом случае будет определена свободная глюкоза + глюкоза, образовавшаяся при расщеплении сахарозы.

Указания к составлению отчета: Содержание глюкозы рассчитывают по

формуле Q=Tглюкозы × (Vйод – Vтиосульфат), где Тглюкозы = 9 мг/мл.

Результат определения глюкозы и сахарозы необходимо выразить в г/кг яблок (количество г глюкозы или сахарозы в 1 кг яблок), или в мг% (количество мг глюкозы или сахарозы в 100 г яблока). Молекулярная масса глюкозы – 180, сахарозы – 342. Написать уравнение реакции гидролиза сахарозы.

Контрольные вопросы:

1)Какие свойства глюкозы положены в основу метода ее определения?

2)Почему для определения сахарозы необходим ее гидролиз?

3)Какие органические соединения, кроме углеводов, находятся в яблоке?

4)Как вы полагаете, какое яблоко будет слаще на вкус, в котором больше глюкозы или сахарозы?

Лабораторная работа № 6 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ

Цель работы: освоить метод разделения и идентификации аминокислот с помощью радиальной распределительной хроматографии на бумаге.

Теоретическая часть

Для изучения аминокислотного состава гидролизатов очищенных белков широко применяют распределительную хроматографию на бумаге – простой, доступный и весьма эффективный метод определения аминокислот.

Метод основан на разной скорости передвижения аминокислот по бумаге в зависимости от коэффициента распределения их между неподвижной (водной) и подвижной (органической) фазами растворителя. Органический растворитель, передвигаясь под действием капиллярных сил, одновременно увлекает

25

за собой нанесенные на бумагу аминокислоты, перемещающиеся с различной скоростью. Скорость зависит от химического строения аминокислот, от их способности быстрее растворяться в органическом подвижном растворителе или, наоборот, в менее подвижном – воде. Расположение отдельных аминокислот обнаруживают путем проявления хроматограмм. Для этого высушенную бумагу обрабатывают раствором нингидрина и затем нагревают ее в сушильном шкафу до 100ОС, то есть проводят качественную нингидриновую реакцию на аминокислоты, находящиеся на бумаге. Скорость перемещения аминокислот выражают коэффициентом распределения. Коэффициент распределения Rf для аминокислоты определяется по уравнению: Rf = a/b, где a – расстояние, пройденное аминокислотой от места старта до середины пятна, b – расстояние, пройденное фронтом растворителя от места старта до финиша.

Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за фронтом органического растворителя и тем больше величина Rf и, наоборот, чем больше растворимость в воде и меньше в органическом растворителе, тем медленнее аминокислота будет передвигаться и тем меньше Rf. Поскольку отдельные аминокислоты в смеси обладают различной скоростью движения, происходит постепенное их разделение.

Величина Rf, кроме химического строения аминокислот и применяемого растворителя, зависит от сорта хроматографической бумаги, ее плотности и окружающей температуры. Коэффициент распределения Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта. Сравнивая Rf известных стандартных аминокислот с Rf аминокислот, полученными для исследуемой смеси, можно качественно определить состав смеси. Подвергая пятна аминокислот элюированию (растворению) и колориметрированию, можно качественно определить даже крайне незначительные количества аминокислот (до 0,1 мкг).

Исследуемый материал: стандартные растворы аминокислот для хроматографии (в 10 мл растворяют 60 мг глутаминовой или аспарагиновой кислоты, 50 мг лейцина, 40 мг глицина или аланина или серина), раствор смеси аминокислот.

26

Реактивы и оборудование

1.Растворитель – смесь н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды в соотношении 15:15:10.

2.0,1% спиртовый или 0,2% ацетоновый раствор нингидрина.

3.Хроматографическая бумага.

4.Карандаш.

5.Линейка.

6.Микропипетка или капилляр.

7.Чашка Петри.

8.Сушильный шкаф, нагретый до 100-105ОС.

9.Пульверизатор.

Экспериментальная часть

Ход работы: Из хроматографической бумаги вырезают квадрат со сторонами 12 см (больше, чем диаметр чашки Петри) и делят карандашом по диагонали на 4 сектора. В центре карандашом делают круг – линию старта. В центре делают небольшой вырез. На линию старта в трех секторах микропипеткой наносят капли трех стандартных растворов аминокислот, а в четвертом секторе наносят каплю определяемой смеси аминокислот. Карандашом подписывают в каком секторе находятся какие аминокислоты и смесь. Квадрат подсушивают на воздухе. В центр квадрата вставляют бумажный фитилек 1,5-2 см высотой.

На дно чашки Петри аккуратно наливают 10 мл растворителя, бумажный квадрат накладывают на края чашки Петри так, чтобы фитилек касался растворителя. Чашку Петри закрывают крышкой, желательно равной по диаметру, и оставляют при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не дойдет до краев чашки. Затем снимают крышку чашки Петри, отмечают карандашом фронт растворителя во всех четырех секторах и хроматограмму сушат в сушильном шкафу 5-10 минут для фиксации аминокислот и испарения растворителя. Растворитель из чашки Петри сливают в отведенную для этого склянку.

Далее хроматограмму проявляют, осторожно опрыскивая ее в вытяжном шкафу из пульверизатора раствором нингидрина. Снова сушат в шкафу для прохождения нингидриновой реакции и проявления аминокислот-свидетелей в виде отдельных пятен в каждом секторе. Для смеси аминокислот наблюдается несколько окрашенных полос.

27

Указания к составлению отчета: Нарисуйте или приклейте в тетрадь хроматограмму. Проведите расчеты Rf. На основании значений коэффициента распределения сделайте вывод о качественном составе аминокислот в смеси.

Лабораторная работа № 7 РЕАКЦИИ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Цель работы: закрепить знания по теме «Физико-химические свойства белков» и овладеть навыками осаждения белков.

Теоретическая часть

Существует большое количество разнообразных реакций осаждения белков. Как правило, реакции осаждения являются первой стадией процесса выделения, очистки, качественного и количественного определения отдельных белков. В зависимости от применяемого осадителя реакции осаждения могут быть обратимыми и необратимыми. В случае обратимых реакций белки не подвергаются глубоким изменениям, и получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе, обычно в воде. Белки при этом сохраняют свои свойства. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям (денатурации), утрачивают свои биологические и физи- ко-химические свойства, становятся менее гидрофильными и теряют способность растворяться в воде.

Исследуемый материал: сыворотка крови или 1% раствор яичного белка.

Реактивы и оборудование

1.10% раствор сульфата меди.

2.Концентрированная азотная кислота.

3.10% раствор трихлоруксусной кислоты.

4.Этиловый спирт или ацетон.

5.Насыщенный раствор хлорида натрия.

6.Штатив с пробирками.

7.Пипетки.

28

Экспериментальная часть

Ход работы: 1. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

Метод основан на связывании ионов тяжелых металлов с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекуле белка, в результате чего разрушается ее пространственная структура и происходит осаждение денатурированного белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме AgNO3 и HgCl2) происходит растворение первоначально образующегося осадка из-за абсорбции иона металла и приобретении вследствие этого белковой молекулой положительного заряда.

К5 каплям исследуемого раствора белка прибавляют осторожно 1 каплю 10% раствора сульфата меди. Образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой такой же порции раствора белка приливают вначале 1 каплю 10% раствора сульфата меди, а затем еще 10 капель и наблюдают растворение осадка в избытке реактива.

2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислота-

ми.

Метод основан на способности минеральных кислот вызывать нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры белка, что приводит

кего денатурации и осаждению. Ортофосфорная кислота осадка не дает. В избытке всех минеральных кислот, за исключением азотной, выпавший осадок белка растворяется.

К5 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке наклоненной пробирки приливают 5 капель исследуемого раствора белка так, чтобы жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца. Осторожно встряхивают пробирку и добавляют избыток азотной кислоты. Осадок не исчезает, так как в избытке азотной кислоты он не растворяется.

3. Осаждение белков органическими кислотами.

Метод основан на способности органических кислот нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка. Органические кислоты вызывают необратимое осаждение белков.

29

Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков. При использовании трихлоруксусной кислоты удается отдельно определить содержание азота белков и азота других азотсодержащих веществ: пептидов, мочевины, аминокислот.

К 5 каплям исследуемого раствора белка добавляют 2 капли 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

4. Осаждение белков органическими растворителями.

Метод основан на способности органических растворителей нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка.

При осаждении спиртом раствор белка должен быть нейтральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция происходит лучше в присутствии электролита хлорида натрия вследствие снятия заряда с частиц белка.

Реакция осаждения белка спиртом при кратковременном действии спирта на холоду обратима. Если осадок быстро отделить от спирта, то белок сохранит нативное состояние и может быть вновь растворим в воде. При длительном воздействии спирта наступает необратимая реакция осаждения, то есть денатурация белка.

К 5 каплям раствора исследуемого белка приливают 15-20 капель этилового спирта (или ацетона). Раствор мутнеет. Добавляют 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия. При стоянии выпадает осадок белка.

Указания к составлению отчета: При составлении отчета указать название веществ, осаждающих белки, характер и цвет осадка, чем обусловлена реакция и ее особенности.

30

Лабораторная работа № 8 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ

Цель работы: определить молекулярную массу белка с использованием гель-хроматографии.

Теоретическая часть

Разделительный гель состоит из гранул с определенным размером пор и межгранульного пространства. Молекулы, размер которых превышает размер пор гранул, движутся только в пространстве между гранулами и первыми выходят из колонки. Молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в гранулы и обратно, поэтому их вымывание (элюирование) из колонки замедляется. Чем меньше молекулярная масса вещества, тем больший объем элюирующей жидкости требуется для вымывания его из колонки.

При гель-хроматографии измеряют объем элюирования для каждого вида молекул. Чем больше объем элюирования, тем меньше молекулярная масса молекул. Молекулярную массу исследуемого вещества можно определить с помощью калибровочного графика.

Реактивы и оборудование:

1)0,9 % раствор NaCI;

2)гель сефадекса (G-200 или G-100);

3)раствор ненасыщенного голубого декстрана;

4)раствор насыщенного раствора рибофлавина;

5)20 % раствор гемоглобина;

6)10 % раствор NaOH;

7)1 % раствор CuSO4;

8)0,5 % раствор нингидрина.

Экспериментальная часть

Ход работы: Колонку для разделения веществ заполняют гелем сефадекса (G-200 или G-100), полученным при гидратировании сефадекса G-200 изотоническим раствором хлористого натрия. Слой NaCI всегда должен находиться над гелем, чтобы он не высыхал. На поверхность геля наносят 2—3 капли раствора, представляющего собой смесь трех веществ: ненасыщенного