4120

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Воронежский государственный лесотехнический университет им. Г.Ф. Морозова

Промышленная биотехнология

Методические указания к лабораторным занятиям для студентов

по направлению подготовки 19.03.01 – Биотехнология

Воронеж 2017

Брындина Л. В. Промышленная биотехнология [Электронный ресурс]: методические указания к лабораторным занятиям для студентов направления подготовки 19.03.01 – Биотехнология / Л. В. Брындина. М-во образования и науки РФ, ФГБОУ ВПО «ВГЛТУ им. Г.Ф. Морозова», – Воронеж, 2017. – 43 с. ЭБС ВГЛТУ.

Лабораторная работа №1 Составление типовых технологических схем

Лабораторная работа №2 Составление питательных сред и их анализ

Лабораторная работа № 3 Расчеты технологических и экономических параметров процесса

Лабораторная работа № 4 Исследование процесса периодической ферментации.

Исследование процесса непрерывной ферментации. Технологические расчеты

Лабораторная работа № 5 Исследование ферментативного гидролиза крахмала

Лабораторная работа № 6 Составление технологического регламента производства

Лабораторная работа №1 Составление типовых технологических схем

Цель: приобрести навыки в составлении технологических схем биотехнологических процессов производства белка, витаминов, углеводов и других продуктов микробиологического синтеза.

Задание:

-составить технологическую схему производства ферментов глубинным способом;

-составить технологическую схему производства ферментов поверхностным способом;

-составить технологическую схему производства витаминов.

Дать описание стадий технологического процесса с указанием условий и режимов их проведения, схематично изобразить производство соответствующей продукции. Отметить недостатки технологий и сделать соответствующие выводы.

Биотехнологическим процессом называют синтез какого – либо вещества (биотехнологического продукта) при непосредственном участии живых микроорганизмов и выделенных из них ферментов – биологических катализаторов. Основными особенностями и отличиями биотехнологического процесса являются: участие микроорганизмов, сложный состав реакционной среды, сложный механизм реакции и длительность еѐ протекания, чувствительность к внешним условиям (стерильности, давлению, температуре и т. П.).

Большое разнообразие биотехнологических процессов, нашедших промышленное применение, приводит к необходимости рассмотреть общие, наиболее важные проблемы, возникающие при создании любого биотехнологического производства. Процессы промышленной биотехнологии разделяют на 2 большие группы: производство биомассы и получение продуктов метаболизма. Однако такая классификация не отражает наиболее существенных с технологической точки зрения аспектов промышленных биотехнологических процессов. В этом плане необходимо рассматривать стадии биотехнологического производства, их сходство и различие в зависимости от конечной цели биотехнологического процесса. В общем виде система биотехнологического производства продуктов микробного синтеза представлена на рис. 1.

Рисунок 1. Типовая схема, основные стадии и технологические процессы в биотехнологических производствах

Существует 5 стадий биотехнологического производства. Две начальные стадии включают подготовку сырья и биологически действующего начала. В процессах инженерной энзимологии они обычно состоят из приготовления раствора субстрата с заданными свойствами (рН, температура, концентрация) и подготовки партии ферментного препарата данного типа, ферментного или иммобилизованного. При осуществлении

микробиологического синтеза необходимы стадии приготовления питательной среды и поддержания чистой культуры, которая могла бы постоянно или по мере необходимости использоваться в процессе. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента – главная задача любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами. Третья стадия – стадия ферментации, на которой происходит образование целевого продукта. На этой стадии идет микробиологическое превращение компонентов питательной среды сначала в биомассу, затем, если это необходимо, в целевой метаболит. На четвертом этапе из культуральной жидкости выделяют и очищают целевые продукты. Для промышленных микробиологических процессов характерно, как правило, образование очень разбавленных растворов и суспензий, содержащих, помимо целевого, большое количество других веществ. При этом приходится разделять смеси веществ очень близкой природы, находящихся в растворе в сравнимых концентрациях, весьма лабильных, легко подвергающихся термической деструкции. Заключительная стадия биотехнологического производства – приготовление товарных форм продуктов. Общим свойством большинства продуктов микробиологического синтеза является их недостаточная стойкость к хранению, поскольку они склонны к разложению и в таком виде представляют прекрасную среду для развития посторонней микрофлоры. Это заставляет технологов принимать специальные меры для повышения сохранности препаратов промышленной биотехнологии. Кроме того, препараты для медицинских целей требуют специальных решений на стадии расфасовки и укупорки, так должны быть стерильными.

Технологические схемы (ТС) разрабатываются на основании принципиальной технологической схемы производства, расчета материальных потоков, расчета и подбора оборудования. ТС показывает последовательность технологических процессов и технологических операций, из которых состоит производственный процесс: поступление, хранение и подготовка сырья для подачи в производство, движение полуфабрикатов, выпуск готовой продукции.

Если производство многостадийное, то схемы могут разрабатываться для каждого участка (цеха) отдельно в соответствии с принципиальной технологической схемой производства.

На ТС изображается все оборудование, располагаемое в технологической последовательности слева направо и сверху вниз с учетом этажности. На чертежах этажи показывают тонкой горизонтальной линией с указанием уровня чистого пола этажа по высоте от «нулевого уровня» – уровня чистого пола 1-го этажа. Расстояние между этажами показывают не в масштабе.

При изображении оборудования на ТС не обязательно придерживаться стандартного масштаба, но требуется соблюдать определенную пропорциональность. Если необходимо изобразить очень большое или очень

малогабаритное по сравнению с другим оборудование, то необходимо отступать от выбранного масштаба. Оборудование часто употребляемое, стандартное, простое часто изображают условно. Важно, чтобы рабочий по изображению на схеме, узнавал его, чтобы можно было показать места подсоединения коммуникаций, связывающих его с другим оборудованием.

Изображение оборудования должно соответствовать его поэтажному размещению. Если оборудование располагается на одном этаже, то схему можно размещать на двух и более параллельных уровнях, но с указанием одной и той же отметки от «нулевого уровня» до пола.

На ТС необходимо показывать потоки объектов производства, а также вспомогательных материалов (пара, конденсата, воды, сжатого воздуха, диоксида углерода и т.д.). Стрелками показывают направления потоков и делаются соответствующие надписи. Если схема окажется очень сложной и трудно читаемой, разрешается в комплекте документации разрабатывать раздельные или сблокированные различные схемы (схемы водопровода и канализации, схема пароснабжения и отвода конденсата, схема снабжения сжатым воздухом, схемы сбора и утилизации диоксида углерода и т.д.).

Если схема окажется сложной, нет необходимости проводить линии потоков от аппаратов до аппаратов, а только точки подключения потоков к аппаратам и стрелками направления потоков, условно указывают материал потоков. Показывают точки местных отсосов, систем аспирации и выпуска воздуха в атмосферу. При этом предполагается, что в комплекте документации будут раздельные или блокированные схемы потоков.

Всем видам оборудования, приведенным на ТС, присваиваются номера позиций, которые указывают на полках линий-выносок, проведенных от изображений оборудования. Присвоенный номер позиции сохраняется за данным аппаратом (машиной) на всех видах проектной документации данного объекта. Категорически запрещается повторения одной и той же позиции на различном оборудовании, даже если оно приведено на другом чертеже данного объекта. Если в комплекте документации встречается несколько схем, то номера позиций оборудования присваивают нарастающим итогом по ходу производственного процесса.

Размещение оборудования на чертеже должно производиться по возможности компактно, но с учетом интервалов, необходимых для изображения всех коммуникаций. Движение основных продуктов (сырья, полуфабрикатов и готовой продукции) на протяжении всей схемы показывают сплошной утолщенной линией (примерно 2…2,5 мм). Она должна сохраняться для всех продуктов, начиная от сырья и кончая готовой продукцией. При этом на линиях, а также в точках ввода в аппаратуру и вывода из нее стрелками показывают направление движения продукта.

Вопросы для самоконтроля

1. Каким образом получают посевной материал?

2.Что необходимо учитывать при разработке технологических схем производства микробных препаратов?

3.Назовите способы культивирования микроорганизмов.

Лабораторная работа №2 Составление питательных сред и их анализ

Цель: Приобрести навыки в приготовлении питательных сред для микроорганизмов. Научиться составлять среды для целенаправленного синтеза микроорганизмов.

Задание:

1.Приготовьте МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера с рН 7,2-7,4, разлейте во флаконы и пробирки; простерилизуйте.

2.Приготовьте из сухих порошков среды Гисса, разлейте в пробирки по 4-5 мл и простерилизуйте.

3.Приготовьте из сухих порошков среды Эндо, ЭМС, Плоскирева и разлейте их в чашки Петри.

4.Приготовьте скошенный агар.

Основной принцип составления питательной среды – это удовлетворение физических потребностей микроорганизмов. Каждый конкретный микробиологический процесс имеет свои особенности на стадии приготовления питательных сред, и это связано с применяемым в данном производстве источником углерода. Растворимые источники углерода (например, сахара) предварительно растворяют в воде, доводя растворы до определенной концентрации в небольших открытых реакторах с мешалками, а затем подают в закрытый реактор – смеситель с плоским дном, снабженный для ввода пара барботажным устройством. Нерастворимые источники углерода тщательно суспендируют в воде в реакторе с мешалкой и переводят

всуспензию в реакторе – смесителе. Крахмалосодержащее сырьѐ предварительно клейстеризуют.

Минеральные соли растворяют в реакторе с мешалкой, а перед подачей

вреактор – смеситель фильтруют для удаления шлама (гипс и другие нерастворимые осадки). Раствор микроэлементов обычно готовится отдельно.

Отделения приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий или эмульсий. При этом питательные соли хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси с заданным соотношением компонентов производится в аппарате с мешалкой, куда подаются твердые компоненты в необходимом количестве и

далее происходит их растворение. Иногда соединяются и перемешиваются заранее приготовленные растворы. Жидкие и твердые источники углерода обычно вводят в уже готовую питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность которого возрастает при хранении готовой питательной смеси.

При непрерывном культивировании в производстве микробного белка углеводороды и растворы солей вводят в ферментер раздельно по индивидуальным линиям, а смешение и эмульгирование нерастворимых в воде n-алканов происходит уже в самом биореакторе. При культивировании бактерий на метане последний постоянно барботируют в аппарат через специальные устройства.

При периодической ферментации в начале процесса инокулят (засевная доза микроорганизмов) вносится в уже готовую питательную среду, содержащую все компоненты. Поэтому источники углерода вводят непосредственно перед засевом или отдельные компоненты среды вводят по мере потребления их культурой, поддерживая в ферментере некоторую оптимальную их концентрацию, которая на разных этапах ферментации может меняться по определенному закону.

В реакторе – смесителе все компоненты тщательно перемешиваются, рН среды доводится до необходимого значения подачей аммиачной воды или кислоты. Реакторы для приготовления питательной среды должны быть снабжены достаточно мощными мешалками, а также перегородками – отражателями, не допускающими завихрения и вращения жидкости. В зависимости от состава используемой питательной среды выбирают тип перемешивающего устройства как в аппаратах для подготовки различных источников углерода (растворение сахаров, разбавление мелассы, клейстеризация крахмала и т. П.), так и в самом реакторе – смесителе для приготовления питательной среды.

Важнейшим элементом приготовления питательных сред является соблюдение требований асептики. Это либо создание заданного значения рН, обеспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо полная стерилизация всех подаваемых потоков и самого биореактора.

Приготовленная в реакторе – смесителе питательная среда должна быть подвергнута стерилизации. Для стерилизации питательных сред используют два метода: при периодическом культивировании – циклический и при непрерывном культивировании – непрерывный.

Циклический метод стерилизации питательной среды очень прост. Эту операцию можно осуществлять непосредственно в ферментере. При этом среда и оборудование стерилизуются одновременно. Чаще всего используют комбинированный нагрев острым и глухим паром. Острый пар подают в питательную среду, а глухой – в рубашку (или змеевик). Острый пар поступает в ферментер через штуцеры для подачи посевного материала, воздуха и для взятия проб. Поэтому вся арматура, соединенная с ферментером, стерилизуется проходящим острым паром.

Так как обработка питательной среды острым паром приводит к образованию конденсата, необходимо заранее учитывать разбавление среды конденсатом и вносить соответствующую поправку в рецептуру приготавливаемой среды. Тогда к концу стерилизации среда будет иметь необходимую концентрацию всех питательных компонентов.

При циклической стерилизации поддерживают температуру 121оС, что соответствует давлению насыщенного пара 100 кПА. Обычно питательные среды выдерживают при такой температуре от 30 – 40 мин. Полный цикл нагревания, выдержки и охлаждения для ферментеров большого объѐма достигает нескольких часов.

Длительная тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Некоторые нестойкие к нагреванию соединения разлагаются, что приводит к потере необходимых для микроорганизмов питательных веществ. Другие соединения могут вступать во взаимодействие между собой с образованием продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов. Большинство изменений химических компонентов в составе питательной среды может происходить при температурах, более высоких, чем температура стерилизации. Следовательно, эффективная стерилизация при минимальном изменении состава среды может быть достигнута применением более высокой температуры, быстрым нагреванием и охлаждением среды. Поэтому в настоящее время циклический метод применяют для стерилизации среды только в аппаратах малого объѐма.

Метод высокотемпературной непрерывной стерилизации, используемый на большинстве заводов, дает возможность свести к минимуму ухудшение питательных качеств среды без снижения эффективности самой стерилизации.

При непрерывной стерилизации можно значительно сократить время стерилизации, а, следовательно, снизить расход пара. Кроме того, этот вид стерилизации легко поддается автоматизации.

Среды должны соответствовать следующим требованиям:

1)быть питательными, т. Е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей. Ими являются источники органогенов и минеральных (неорганических) веществ, включая микроэлементы. Минеральные вещества не только входят в структуру клетки и активизируют ферменты, но и определяют физико-химические свойства сред (осмотическое давление, рН и др.). При культивировании ряда микроорганизмов в среды вносят факторы роста – витамины, некоторые аминокислоты, которые клетка не может синтезировать;

2)иметь оптимальную концентрацию водородных ионов – рН, так как только при оптимальной реакции среды, влияющей на проницаемость оболочки, микроорганизмы могут усваивать питательные вещества.

Для большинства патогенных бактерий оптимальна слабощелочная среда (рН 7,2-7,4). Исключение составляют холерный вибрион – его оптимум