3285

УДК 575 Колесникова, Е. О. Биотехнология растений Текст: Методические

указания к лабораторным работам для студентов по направлению подготовки 19.03.01Биотехнология, профиль - Промышленная экология / Е.О. Колесникова; ВГЛТУ. – Воронеж, ВГЛТУ, 2017. – ЭБС ВГЛТУ. – 21 с.

2

Техника безопасности при выполнении лабораторных работ

Правила работы в биотехнологической и химической лаборатории

Перед лабораторной работой изучите теоретический раздел и описание лабораторной работы. Покажите преподавателю конспект теоретической и практической части лабораторной работы. Сдайте преподавателю допуск для проведения лабораторной работы.

Ознакомьтесь с методикой выполнения лабораторной работы.

В соответствии с техникой безопасности запрещается:

-брать реактивы больше требуемого количества;

-неизрасходованные или взятые в избытке реактивы возвращать обратно в склянки (их надо сдать лаборанту);

-загромождать рабочее место (во время работы на лабораторном столе должны находиться только необходимые приборы, реактивы и лабораторная тетрадь);

-уносить приборы, реактивы общего пользования на свое рабочее

место;

-путать пробки от склянок;

-принимать пищу в лаборатории;

-работать в лаборатории в неаккуратно застегнутой одежде, с распущенными волосами;

-нагревать на открытом огне горючие жидкости;

-сливать горячие растворы в толстостенную посуду.

Необходимо выполнять следующие требования.

Перед началом работы следует ополоснуть чистую посуду дистиллированной водой над раковиной, затем при необходимости высушить еѐ.

После окончания работы следует тщательно вымыть посуду.

Склянки и реактивы должны находиться в определенном месте, их нельзя переносить на другие столы.

Следует работать без лишней торопливости, не проливать и не просыпать реактивы, если все же это случилось, нельзя сливать загрязненный реактив обратно в склянку с чистым реактивом, а следует собрать его и передать лаборанту; стол (или другой запачканный предмет) нужно вымыть и вытереть.

4

Бросать бумагу, бытовое стекло и другие предметы можно только в специальные сосуды и ящик для мусора.

Если во время работы будет пролита в большом количестве кислота или другой раствор, нужно тотчас сообщить о случившемся лаборанту.

Удалять растворы нужно быстро, так как эти реактивы портят стол и другие предметы, и осторожно, чтобы не прожечь одежду и не повредить руки.

При всех несчастных случаях необходимо тотчас обращаться к лаборанту или преподавателю.

Внимательно наблюдать за ходом опыта, отмечая и записывая каждую его особенность (выпадение и растворение осадков, изменение окраски, температуры и т.д.).

Расходовать для осуществления химических реакций то количество реактивов, которое рекомендовано в указаниях по выполнению опыта, а если нет специальных оговорок – минимальное.

Работы с вредными веществами проводить только под тягой. Концентрированные кислоты и щелочи наливать осторожно в вытяжном шкафу; не уносить их на свои рабочие столы.

Если случайно прольете кислоту или щелочь, то быстро смойте их интенсивной струей воды из водопроводного крана, а потом обратитесь к дежурному лаборанту и по его указанию приведите в надлежащий порядок свое рабочее место.

Не выливать в раковину отработанные концентрированные кислоты и щелочи, а пользоваться для этого специально отведенной посудой, установленной под тягой. Отработанные металлы складировать в специальную емкость. Бумагу и остатки твердых веществ бросать в урну.

При работе постоянно следить за тем, чтобы реактивы (особенно кислоты, щелочи) не попадали на лицо, руки, одежду.

При нагревании реактивов или жидкостей не наклоняться над сосудом во избежание попадания брызг на лицо, одежду, обувь.

При нагревании жидкостей в колбе не держите ее отверстием к себе или в сторону соседа.

Не нюхайте выделяющиеся газы, близко наклоняясь к сосуду. Если нужно понюхать газ, то следует сделать это осторожно, слегка направляя рукой поток воздуха к себе.

5

В случае ожога (пламенем горелки или горячим предметом) обожженное место смочить крепким раствором марганцовокислого калия. Можно приложить ватку, смоченную жидкостью от ожога.

При разбавлении щелочей, кислот и т.п. веществ, а также при мытье посуды с веществами, разъедающими кожу рук, обязательно надевать резиновые перчатки.

В конце работы уберите рабочее место, выключите воду, электроприборы.

При работе с электроприборами необходимо соблюдать

следующие правила.

Работу с приборами можно начинать только после тщательного ознакомления с инструкцией по их эксплуатации.

Включать приборы только в сеть переменного тока с напряжением

220 В.

Электроприборы должны располагаться на лабораторном столе таким образом, чтобы химические реактивы не попадали на них, а также в электрическую розетку.

Если произошло замыкание электроустановки или возник пожар, необходимо немедленно обесточить прибор. Тушить пожар следует песком и огнезащитной тканью.

Приборы должны иметь рабочую изоляцию, элемент для заземления.

В электроприборах имеются элементы, находящиеся под напряжением, поэтому запрещается самостоятельно вскрывать и ремонтировать их, а также работать с неисправными приборами.

После окончания работы необходимо отключить прибор от сети.

6

Лабораторная работа № 1

Биотехнология производства культуры клеток, тканей и органов растений. Организация и особенности работы в условиях биотехнологической лаборатории.

Цель работы: ознакомиться с особенностями организации и работы в биотехнологической лаборатории.

Общие сведения.

Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов, тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений, могут облегчить и ускорить традиционный процесс создания новых сортов и видов. Они предлагают принципиально новые пути, такие как сомаклональная изменчивость, мутагенез на клеточном уровне, клеточная селекция, соматическая гибридизация для создания генетического разнообразия и отбора форм с искомыми признаками. Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании безвирусного материала вегетативно размножаемых растений.

Пионером клонального микроразмножения считается французский ученый Жан Морель, который в 50-х годах прошлого столетия получил первые растения – регенеранты орхидей. В это время техника культивирования апикальных меристем in vitro была уже хорошо разработана. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы и т.д. В нашей стране работы по микроклональному размножению были начаты в 30-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ИФР РАН. Под руководством Р.Г. Бутенко были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы и др. растений и предложены промышленные технологии.

В дальнейшем исследования по микроклональному размножению охватили и древесные растения. Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов ХХ-го столетия и связаны с именем Готре, который показал, что камбиальные ткани некоторых растений способны к каллусогенезу in vitro. Но первые растения - регенеранты осины, доведенные до почвенной культуры, были получены лишь в середине 60-х годов Матесом.

Культивирование тканей хвойных пород in vitro долгое время редко использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования тканей, изолированных из растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные растения

7

характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и т.д.), которые в изолированных тканях активируются. Окисленные фенолы обычно ингибируют деление и рост клеток, что ведет к гибели первичного экспланта или уменьшению способности тканей древесных растений к регенерации адвентивных почек, которая с возрастом растения-донора исчезает практически полностью. В настоящее время, несмотря на перечисленные трудности, насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, сосна, ель, секвойя и др.).

Для организации биотехнологической лаборатории необходимы просторные изолированные помещения, а также современное оборудование и высококачественные реактивы. Для удобства проведения дезинфекции полы стены и потолок в помещениях должны иметь водостойкое и ультрофиолетоустойчивое покрытие.

Оборудование моечного помещения: должны быть глубокие раковины из кислотостойкого материала и краны с горячей и холодной водой; дистилляторы и бидистилляторы; сушильные шкафы с режимом работы для сушки посуды до 100-130 0С, для инструментов до 170 0С, шкафы для хранения чистой посуды и инструментов, емкости для хранения моющих средств, вытяжные шкафы с эксикаторами для хромпика (H2SO4 98 % + K2CrO7).

Оборудование помещения для приготовления питательных сред: лабораторные столы, холодильники для хранения растворов солей, гормонов и витаминов; аналитические и торсионные весы; иономер, магнитные мешалки, плитки, набор посуды (колбы, стаканы, мерные цилиндры, мензурки, пробирки и т.д.), необходимый набор химических реактивов надлежащей степени чистоты (ХЧ, Ч, ЧДА).

Оборудование помещения для стерилизации: стерилизаторы паровые, стеллажи, шкафы для хранения стерильных материалов. Данное помещение должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и иметь канализационный слив для отвода конденсата из автоклава.

Оборудование помещения для манипуляций с растительными эксплантами: ламинарный бокс с бактерицидными лампами, лабораторные столы, стеллажи, шкафы для материалов и оборудования.

Оборудование культуральных помещений: световое отделение – источники освещения со спектром близким к спектру дневного света (от 3 до 10 kLx), кондиционер для регуляции температуры (24 0С), стеллажи

8

культивирования растительного материала; темновое отделение с тем же оборудованием, исключая источники освещения.

Необходимые условия для работы с культурой изолированных тканей: Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей

является соблюдение строгой стерильности. При работе в стерильном помещении лаборатории все сотрудники бактериологической лаборатории обязаны соблюдать следующие правила работы, которые обеспечивают стерильность в работе и предупреждают возможность возникновения внутрилабораторных заражений:

1.Все лица, находящиеся в лаборатории, должны быть в халатах, сменной обуви (либо бахилах), белой шапочке или косынке.

2.В помещении запрещается прием пищи и курение, хранение продуктов питания.

3.Нельзя вносить в лабораторию посторонние вещи.

4.Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнее платье на халат.

5. Каждый работник должен пользоваться только своим рабочим местом.

6. Все операции должны производиться с соблюдением правил стерильности: все стерильные работы проводят вблизи пламени горелки, переливание зараженных жидкостей производят над лотком с дезинфицирующим раствором и т. п.

7.Нужно строго следить за чистотой рук: по окончании работы с заразным материалом их дезинфицируют. Рабочее место в конце дня приводят в порядок и тщательно дезинфицируют.

8.Весь инвентарь, находившийся в контакте с заразным материалом, подлежит стерилизации или уничтожению. Биотехнологическую лабораторию необходимо содержать в чистоте. Следует регулярно проводить гигиеническую уборку помещений лаборатории. Обеспечить полную стерильность лаборатории очень трудно и это не всегда необходимо, но значительно снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях в лабораторных помещениях возможно. Это достигается путѐм применения на практике методов дезинфекции, то есть уничтожения возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды.

Для стерильных пересадок при работе с культурой тканей используется ламинар-бокс, оснащеные УФ лампами. рабочую поверхность нужно протерать 70 %-ным этанолом. Чистую посуду, инструменты стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 С в течение 1,5–2 ч. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции.

9

Питательные среды для культивирования растительных тканей стерилизуют автоклавированием под давлением 0,5–1 атм.

Материалы и оборудование: Химические стаканы (50, 100, 250 мл),

штативы с пробирками, инструменты (пинцеты, скальпели, ножницы, препарировальные иглы), моющие средства (стиральный порошок), хромпик, гипохлорит натрия.

Ход работы.

1.Ознакомиться с устройством биотехнологической лаборатории.

2.Под руководством преподавателя освоить принципы работы автоклава, сушильного шкафа, дистиллятора и другого вспомогательного оборудования.

3.Посуду замочить в растворе гипохлорита натрия, тщательно отмыть

врастворах детергентов (стиральный порошок), промыть 8-10 раз проточной водой, поместить на 4-6 часов в хромпик (смесь серной кислоты с бихроматом калия), промыть теплой водой, затем дважды дистиллированной.

4.Чистую посуду поместить в сушильный шкаф на 2 часа при температуре 100-130оС.

5. Заполнить таблицу «Основные помещения лаборатории и их оборудование».

Вопросы и задания для самоконтроля

1.Как устроена биотехнологическая лаборатория?

2.Как простерилизовать питательные среды, посуду, дистиллированную воду, инструменты?

3.Как происходит стерилизация помещения лаборатории?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №2

Макро- и микроэлементы. Изучение солей, содержащих элементы минерального питания.

Цель: Изучить соли, содержащие элементы минерального питания, научиться приготавливать маточные растворы.

Общие сведения.

Растительные объекты in vitro культивируют на питательных средах, которые являются основным фактором успешного получения культуры растительных клеток и тканей.

10