3202

УДК 630*(075)

Исаков И.Ю., Сиволапов А.И.

Биотехнология в лесном комплексе [Текст]: методические указания к лабораторным работам для студентов по направлению подготовки

19.03.01 – Биотехнология / И.Ю. Исаков, А.И. Сиволапов; Мин.

Образования и науки РФ, ФГБОУ ВО «ВГЛТУ».- Воронеж, 2017.- 34 с.

ВВЕДЕНИЕ

Потенциал современной биотехнологии позволяет находить новые решения вопросов генетического улучшения селекционного материала и повышения биоразнообразия. Лесная биотехнология - одна из молодых,

интенсивно развивающихся дисциплин в лесном хозяйстве мира, тесно связанная с целями и задачами лесной генетики и селекции. В лесном хозяйстве России биотехнология интегрирована в "Комплексную программу развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года".

Реализация Программы в части приоритетного направления "Лесная биотехнология" приведет к созданию в стране современной системы управления лесонасаждениями с привлечением методов ДНК маркирования,

созданию новых биотехнологических форм деревьев с заданными признаками, развитию плантационного лесовыращивания, созданию условий для малоотходной переработки древесины, утилизации отходов лесопиления,

а также к созданию спроса на современные экологически безопасные средства защиты леса.

Раздел 1

Клеточная инженерия - одно из наиболее важных направлений биотехнологии. Объектами ее исследований являются изолированные культуры клеток и тканей эукариотических организмов. Основной метод клеточной инженерии - культивирование изолированных клеток, тканей и органов растений. В основе его лежат тотипотентность растительных клеток и способность их к регенерации.

Основополагающим условием для работы с культурами изолированных тканей является соблюдение условий асептики (стерильности). Все манипуляции с изолированными тканями проводят только в ламинар-боксе,

стерильными инструментами. Стеклянную посуду, используемую в работе,

стерилизуют в термошкафу сухим жаром, питательные среды - в автоклаве.

Перед тем, как растительную ткань ввести в культуру, проводят поверхностную стерилизацию, освобождая ее от сапрофитных микроорганизмов, находящихся на поверхности.

Для успешного культивирования изолированных тканей растений крайне важно соблюдать определенные условия их выращивания:

поддерживать оптимальный режим освещения (3000 - 10000 лк), фотопериод

(различный для разных растений), температурный режим (для большинства растений 25 - 26 С), уровень влажности (60 - 70 %). Оптимальные условия для культивирования растительной ткани можно создавать при использовании климатических камер.

Работа 1.

Биотехнология как наука: цели, задачи, предмет изучения; основные

понятия и термины.

Материалы и оборудование: приборы и оборудование в лаборатории по культивированию изолированных клеток, органов и тканей растений.

Объяснение. Биотехнология - наука о клеточных методах и генно-

инженерных технологиях создания и использования биологических объектов

(растений, животных, микроорганизмов) с целью интенсификации производства или получения продуктов различного назначения.

Биотехнология является комплексной наукой; она использует методы и приемы микробиологии, биохимии, молекулярной биологии, химии,

биофизики, вирусологии, иммунологии, генетики, достижения в области инженерных наук и электроники. Биотехнология в настоящее время получила широкое развитие, стала приоритетным звеном высоких технологий современного производства и используется во многих его отраслях (рис. 1). Основой биотехнологии, ее фундаментом является

биоинженерия, которая включает два направления: клеточную и генетическую инженерию.

Клеточная инженерия занимается изучением клеток, тканей и органов растений, культивируемых in vitro. Основным методом клточной инженерии является метод культивирования изолированных растителльных тканей на искусственных питатльных средах в стерильных условиях (in vitro).

Объекты исследований генетической инженерии - хромосомы и гены растений; в основе методов этой науки лежат манипуляции, направленные на создание искусственных генетических программ.

Потенциал современной биотехнологии позволяет находить новые решения вопросов генетического улучшения селекционного материала и повышения биоразнообразия. Пути использования метода культивирования изолированных клеток, органов и тканей в производстве показаны на рис. 2.

Ход работы: записать в тетрадь основные термины, используемые в биотехнологии, объяснить их смысл.

Работа 2.

Оборудование и организация работы в лаборатории биотехнологии.

Материалы и оборудование: лабораторная посуда и инструменты, мерная посуда, приборы (ламинар-бокс, автоклав, дистиллятор, сушильные шкафы, термостат, электроплитка, pH-метр, весы технические и аналитические), химические реактивы.

Объяснение. Главным требованием при организации и техническом оснащении лаборатории по культуре изолированных клеток, органов и тканей является обеспечение условий асептики на всех этапах проведения работ.

Процесс культивирования растительной ткани состоит из нескольких этапов:

Подготовка лабораторной посуды;

Приготовление питательных сред;

Стерилизация посуды, инструментов и питательных сред;

Поверхностная стерилизация растительной ткани и введение ее в культуру;

выращивание изолированных клеток и тканей;

Изучение культивированного материала;

Каждый этап должен проводиться в отдельном помещении, поэтому лаборатория по культуре тканей должна иметь не менее 5-6 комнат.

Подготовка лабораторной посуды к работе проводится в моечной комнате. Она оборудуется мойкой с горячей и холодной водой, дистиллятором, сушильными шкафами, лабораторными столами, шкафами для хранения посуды. Посуду моют, используя бытовые моющие средства, тщательно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, сушат. Перед стерилизацией горлышки культуральных сосудов сушат, закрывают фольгой, чашки Петри заворачивают в плотную бумагу или помещают в биксы. Пинцеты, скальпели, ножницы и др. инструменты стерилизуют в ламинар-боксе, обжигая в пламени спиртовки непосредственно перед использованием.

Питательные среды готовят в специальной (средоварочной) комнате. Здесь должны находиться весы (технические и аналитические), рН-метр, стеллажи или шкафы для хранения посуды и реактивов, лабораторные

столы, холодильник, вытяжной шкаф для работы с вредными для здоровья веществами.

Встерилизационной комнате проводится стерилизация посуды, инстрментов и питательных сред. В ней размещаются сушильные шкафы и автоклавы. Подготовленную посуду стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при t не менее двух часов или паром в автоклаве 1 час при давлении 1 атмосфера.

Питательные среды стерилизуют в автоклаве при давлении 1,2 атм. в течении 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся под действием высоких температур, их растворы пропускают через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,22...0,45 мкм и добавляют в питательную среду после автоклавирования, когда она охладится до 40 С.

Воперационной комнате устанавливается ламинарный бокс. Она должна быть изолирована от сквозняков и других источников загрязнения воздуха микроорганизмами или их спорами. Здесь осуществляют поверхностную стерилизацию и изоляцию растительной ткани, вводят ее в культуру, проводят пересадку (субкультивирование). Комната оборудуется лампами ультрафиолетового облучения (УФ); перед работой обязательно проводится влажная уборка с использованием дезинфицирующих средств. В самом ламинар-боксе стерильность поддерживается за счет постоянной подачи воздуха через специальные фильтры, обеспечивающие его механическую и бактерицидную очистку (продувки), обязательной ультрафиолетовой обработки перед работой с последующей 30-минутной продувкой, тщательной обработки внутренних поверхностей ламинар-бокса этиловым спиртом.

Работа 3.

Приготовление питательных сред для культивирования изолированных клеток, тканей и органов растений.

Материалы и оборудование: лабораторная посуда (в том числе мерная), соли, входящие в состав питательной среды Мурасиге-Скуга, агар, сахароза, цитокинин 6-бензиламинопурин (БАП), весы технические и аналитические, дистиллятор, дистиллированная вода, рН-метр, электроплитка, автоклав, ламинар-бокс.

Объяснение: Успешное развитие растительных тканей in vitro во многом определяется составом питательной среды.

Компоненты питательных сред можно разделить на шесть групп:

Основные неорганические питательные вещества (макроэлементы), соли азота, фосфора, калия, кальция, магния, железа, серы;

Микроэлементы – соли цинка, меди, бора, марганца, кобальта, молибдена, йода;

Источник железа;

Органические добавки (витамины);

Источники углерода (сахара);

Регуляторы роста растений (фитогормоны цитокинины и ауксины в различных сочетаниях).

Для улучшения доступа железа в клетки растений в широких пределах рН в состав питательной среды входит этилен диамин тетрауксусная кислота (ЭДТА), или еѐ натриевая соль (трилон Б). Для отвердения среды используют агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей рода ламинария. С водой агар образует гель (желе), плавящийся при температуре 100оС и затвердевающий при 30 . . .40оС. В составе агара имеются некоторые витамины и другие факторы, положительно влияющие на рост растительных клеток. Кроме агара используют и другие желеобразующие вещества, например, герлит. В кислой среде агар теряет свойства геля и питательная среда может не затвердеть, поэтому при приготовлении питательных сред очень важно устанавливать оптимальный уровень рН (до 5,7); при этом следует учитывать, что при автоклавировании происходит незначительное снижение рН (на 0,1 единицу).

Выбор питательной среды осуществляется с учетом видовых и сортовых особенностей растений, а также целей эксперимента; наиболее часто используется питательная среда Мурасиге-Скуга (Таблица 1).

Для удобства в работе все компоненты питательных сред разбивают на группы: макро-, микросоли, витамины. Среди макросолей отдельно готовят соли Са (группа Б), поскольку они с другими солями могут образовывать хлопьевидный осадок, и хелаты железа (группа В), для приготовления которых требуется нагревание растворов.

Таблица 1.

Питательная среда Мурасиге-Скуга.

Для рационального использования рабочего времени растворы макро- и микросолей, а также витаминов и фитогормонов готовят заранее, делая их более концентрированными, что позволяет использовать их в течение длительного времени. Такие концентрированные растворы называются маточными, для каждой группы они готовятся в отдельной посуде. При приготовлении растворов все вещества, входящие в их состав, растворяются последовательно. Для приготовления маточных растворов макросолей, концентрацию компонентов увеличивают в 10 раз, для микросолей – в 100 раз, и те и другие растворяют в 1 литре дистиллированной воды.

Раствор соли кальция (группа Б) готовится аналогично, при этом навеска CaCl2 x H2O растворяется постепенно в теплой дистиллированной воде с подогревом до полного растворения вещества.

В качестве регуляторов роста и развития растительной ткани используют цитокинины: БАП, кинетин, зеатин; и ауксины: индолил-3-уксусная кислота (ИУК), α-нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). Их растворяют в 1Н NaOH, растворы стерилизуют или в

автоклаве, или пропускают через мелкопористый фильтр, хранят в холодильнике.

Для приготовления 1 литра рабочего раствора питательной среды берут следующие соотношения маточных растворов:

100 мл макросолей;

100 мл соли кальция, 10 мл микросолей;

5 мл раствора хелата железа;

10 мл раствора витаминов.

Все маточные растворы хранят в холодильнике плотно закрытыми. Перед употреблением проверяют на наличие осадка, плесени, и только убедившись в их отсутствии, используют для приготовления питательной среды.

Количество сахарозы и агара в 1 литре питательной среды составляет соответственно 30 и 9 г.

Перед автоклавированием определяют рН питательной среды, доводя его уровень до 5,6 – 5,8, который является физиологически оптимальным для поглощения растительной тканью питательных веществ.

Ход работы. В соответствии с данными таблицы 1 с точностью до 1 мг взвесить необходимые навески; приготовить маточные растворы; на их основе приготовить 1 л питательной среды; довести рН до 5,6 – 5,7; добавить агар; простерилизовать питательную среду в автоклаве, разлить в ламинарбоксе по культуральным сосудам.

Работа 4.

Методы стерилизации при проведении работ с культурой изолированных клеток, тканей и органов растений; получение стерильных проростков сосны обыкновенной

Материалы и оборудование: химические стаканы, колбы, чашки Петри, скальпели, пинцеты, пробирки с питательными средами, стерильная дистиллированная вода, мертиолят, отбеливатель «Белизна», спирт, спиртовая горелка, этиловый спирт, ламинар-бокс.

Объяснение. Одним из необходимых условий для успешной работы с культурой изолированных тканей является соблюдение асептики. Богатая по составу питательная среда, используемая для культивирования растительной ткани, является благоприятным субстратом для развития микроорганизмов, содержащихся как на поверхности экспланта, так и на лабораторной посуде, инструментах, рабочих поверхностях, руках и одежде исследователя.