3202

Развиваясь на питательной среде, микроорганизмы выделяют продукты своего метаболизма, изменяют ее состав; кроме того, они могут развиваться и на самом экспланте, приводя его к гибели. Поэтому перед введением в

культуру проводят поверхностную стерилизацию растительного материала, все манипуляции с культурой изолированных тканей осуществляют в ламинар-боксе, используя стерильные питательные среды, стерильную посуду и инструменты, соблюдая при этом правила асептики.

Стерилизация ламинар-бокса. В ламинар-боксе размещают спиторку, спички, емкость с 96 % спиртом, стерильную посуду и инструменты, необходимые для работы.

Перед работой ламинар облучают бактерицидной ультрафиолетовой лампой в течение 20…30 мин, затем осуществляют продувку в течение не менее 30 мин, после чего все поверхности обрабатывают спиртом и приступают к работе. Перед работой руки моют с мылом и протирают спиртом, работают в чистых халатах.

Стерилизация посуды. Посуду моют, используя бытовые моющие средства, тщательно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают, заворачивают в плотную бумагу или помещают в биксы. После этого еѐ стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при 160 С в течение не менее 2 часов или влажным паром в автоклаве 1 час при давлении 1 атм (121 С).

Стерилизация питательных сред. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм, в течение 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, не выдерживающие высокой температуры, их стерилизуют, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,2…0,45 мкм и добавляют в автоклавированную, остывшую до 40 С питательную среду.

Поверхностная стерилизация растительного материала проводится с целью освобождения растительных тканей от микроорганизмов. Получение первичных культур является сложной задачей, поскольку поверхность всех органов растений заселена сапрфитными грибными и бактериальными организмами или их спорами, которые in vitro получают возможность для бурного роста и развития и подавляют рост растительной ткани. Поэтому перед посадкой эксплантов на питательную среду их необходимо освободить от внешних сапрофитов, т.е. провести поверхностную стерилизацию. Внутренние ткани растений считаются стерильными, однако в ряде случаев в них могут находиться сапрофитные микроорганизмы, которые не всегда обнаруживаются визуально. Основным условием успешного введения

исходного материала в культуру является правильно подобранная и проведѐнная поверхностная стерилизация.

Поверхностная стерилизация проводится в несколько этапов:

-механическая очистка растительной ткани от почвы и растительных остатков; -Тщательная промывка бытовыми моющими средствами;

-Ополаскивание дистиллированной водой; -Обработка дезинфицирующим веществом;

-прмывка стерильной дистиллированной водой;

-обработка в растворе антибиотика.

В качестве дезинфицирующих веществ используют различные химические вещества, при этом их концентрация и длительность воздействия подбираются индивидуально в зависимости от особенностей растительного объекта (табл. 2). На подготовительном этапе (для удаления воскового налета на плотных кожистых листьях) используется 700 этиловый спирт (С2Н5ОН), который, кроме того, добавляют к другим дезинфекторам для усиления их действия.

Для поверхностной стерилизации используют следующие вещества:

-содержащие активный хлор: хлорамин-В, гипохлорит натрия (NaClO), кальция Са(ClO)2, бытовые отбеливающие средства («Белизна»); наиболее сильное действие на растительную ткань оказывает гипохлорит кальция, наиболее слабое – хлорамин; растворы хлорсодержащих веществ обязательно должны готовиться непосредственно перед употреблением, так как при долгом хранении содержание активного хлора уменьшается;

-содержащие активный кислород: перекись водорода (Н2О) или смесь перекиси водорода с этиловым спиртом (1:1), марганцовка (КМnO4);

-ядовитые вещества: диацид, сулема, мертиолят; наиболее сильно на растительную ткань действует мертиолят, несколько слабее – сулема, самый слабый из ядов – диацид.

Таблица 2 Вещества и способы поверхностной стерилизации растительного материала

Культура каллусной ткани, индукция морфогенеза

Материалы и оборудование: культуральные сосуды с каллусной тканью из различных органов растений; культуральные сосуды с каллусогенными средами; стерильная посуда, инструменты, пробирочные растения; этиловый спирт, спиртовая горелка, ламинар-бокс.

Объяснение. Каллусная культура – это неорганизованная пролиферирующая (беспорядочно делящаяся) ткань, состоящая из дедифференцированных (неспециализированных) клеток.

Каллус может образоваться как in vitro (на изолированных фрагментах растительной ткани - эксплантах), так и in vivo (на раневой поверхности растений).

Различают морфогенные и неморфогенные каллусные ткани. Морфогенная ткань имеет светло-зеленую окраску, в ней легко инициируются процессы органогенеза. Неморфогенная каллусная ткань in vitro имеет белую или желтоватую окраску, к органогенезу она не способна. С возрастом в каллусных тканях накапливаются фенолы и они приобретают темно-коричневую окраску.

Культуры каллусов могут быть получены практически из любой части растения (корней, побегов, листьев) или из определенных типов клеток (эндосперма, пыльцы). Выбор экспланта для получения каллуса определяется задачами исследования. Из молодых тканей каллусные культуры получить проще, чем из старых. Каллусогенная активность культур из специализированных тканей (например, эндосперма) зависит от времени введения их в культуру. Хорошим исходным материалом для получения каллуса являются семена. В этом случае в качестве экспланта используют стерильные проростки корней, стеблей, семядольные листья. Размер и форма исходного экспланта, как правило, не оказывают влияния на пролиферацию каллуса, но экспланты размером менее 0,5 см калуссогенной активностью не обладают.

В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусная ткань различается по консистенции, она может быть:

-рыхлой, такие каллусы состоят из оводненных клеток, которые легко распадаются на отдельные мелкие агрегаты;

-средней плотности; такие каллусы имеют хорошо выраженные меристематические зоны;

-плотной; в такой каллусной ткани могут дифференцироваться элементы проводящей системы.

Превращение специализированных растительных клеток в каллусные связано с индукцией клеточного деления, этот процесс регулируется соотношением фитогормонов (ауксинов и цитокининов).

Специализированные (дифференцированные) клетки утрачивают способность к делению. После дедифференцировки (когда клетки как бы возвращаются в меристематическое состояние), они могут приобрести эту способность вновь, и тогда их деления и неорганизованный рост приводят к образованию каллусной ткани. Дедифференцировку вызывают ауксины, под их действием клетки подготавливаются к делениям; цитокинины вызывают пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток. Дедифференцировке клеток способствует повреждение тканей, поэтому для получения каллуса дифференцированную ткань (листья, стебель и т.д.), перед тем как их поместить на каллусогенные среды, надрезают.

Образование каллусной ткани происходит в течение 3-8 недель. После того, как размер каллуса становится достаточным для пересадки (около 2,0х2,0 см), его можно пересаживать на свежую питательную среду.

Ход работы. В ламинар-боксе с соблюдением условий стерильности вынуть из пробирок проростки семян сосны, измельчить их стерильным лезвием, поместить на поверхность каллусогенной среды и слегка вдавить для обеспечения хорошего контакта со с средой.

Можно использовать и растения-регенеранты: отделить листья, разрезать их стерильным лезвием вдоль центральной жилки и поместить на поверхность каллусогенной среды.

Культуры инкубировать в темноте при температуре 25 С в течение 3…5 недель, каждую неделю просматривать их и проводить учет, отмечая состояние тканей, момент потери ими зеленой окраски, начало образования каллусной ткани, место еѐ появления; рассмотреть и зарисовать образовавшийся каллус.

РАБОТА 6.

Субкультивирование каллусных культур и снятие ростовых характеристик.

Материалы и оборудование: культура каллусной ткани; стерильные чашки Петри, бумажные фильтры, инструментарий; культуральные сосуды питательной средой; лупы; этиловый спирт, спиртовая горелка, ламинарбокс.

Объяснение. Рост каллусных клеток в культуре графически можно отобразить в виде S-образной кривой, состоящей из пяти фаз (рис. 3)

Во время латентной фазы клетки не делятся, они только увеличиваются в размерах и ткань разрыхляется. Во время логарифмической фазы клетки начинают активно делиться, происходит интенсивное (с ускорением) нарастание массы каллусной ткани. Линейная фаза характеризуется наиболее активным (с постоянной скоростью) делением клеток. Во время четвертой фазы темп деления и рост клеток снижаются. Во время пятой (стационарной) фазы начинается отмирание клеток, при этом масса каллуса не увеличивается, ростовая линия выходит на плато, завершается цикл развития каллусной клетки. Обычно это происходит через 28-30 дней после посадки каллуса на свежую питательную среду. Этот срок составляет цикл выращивания каллусной культуры. Для того, чтобы сохранить способность к делению и дальнейшему росту, каллусную ткань необходимо пассировать – переносить на свежую питательную среду. Для этого стерильным скальпелем срезают вновь образованный каллус, разделяют его на кусочки не менее 0,5Х0,5 см (для каждого вида растений существует свой оптимальный размер пересадочной куллусной культуры, который определяется экспериментально) и переносят их на свежую питательную среду. Линии каллусных культур требуют регулярной пересадки через каждые 4 недели. Такую пересадку можно производить неограниченное число раз, но при этом надо помнить, что при длительном культивировании свойства каллусных тканей могут меняться.

Рис. 3. Ростовая кривая при периодическом культивировании каллусных тканей. Фазы роста: 1 – латентная; 2 – логарифмическая; 3 – линейная; 4 – замедления; 5 – стационарная.

Следует обращать внимание на размеры кусочков каллуса, переносимого на свежую питательную среду: если они слишком малы (менее 0,5 см), в дальнейшем рост каллусной культуры может угнетаться.

РАБОТА 7

МЕТОД СОМАТИЧЕСКОГО ЭМБРИОГЕНЕЗА

Материалы и оборудование: растения-регенеранты березы, полученные путем клонального микроразмноженеия, культуральные сосуды со средой Мурасиге и Скуга приготовленной на герлите с добавлением ауксина 2,4-Д, пинцеты, скальпели, этиловый спирт 96 , спиртовая горелка, ламинар-бокс.

Объяснение. В основе метода соматического эмбриогенеза лежит дифференциация из соматических клеток соматических эмбриоидов - биполярных зародышеподобных структур, имеющих две меристемы, одна из которых дает начало корню, другая - стеблю. По внешнему виду эмбриоиды напоминают зиготические зародыши (возникающие в результате полового процесса), но отличаются от них происхождением - соматические зародыши развиваются асексуально, вне зародышевого мешка.

Индуктором соматического эмбриогенеза является ауксин 2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д). Его присутствие в среде культивирования вызывает дифференциацию соматических клеток и превращение их в эмбриональные. Постепенное снижение содержания ауксина в питательной среде (до 0) способствует развитию эмбриональных клеток в эмбриоиды. В своем развитии эмбриоиды проходят три стадии: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную, после чего формируется «зародыш», прорастающий в «проросток».

Соматический эмбриогенез может происходить как непосредственно в тканях экспланта (прямой эмбриогенез), так и в каллусе, полученном из этих тканей (непрямой эмбриогенез). При индукции эмбриогенеза очень важно правильно определить стадию развития и физиологическое состояние донорных тканей. Лучше для этих целей использовать незрелые

зародыши, полностью дифференцированные ткани, как правило, не дают начала эмбриогенным культурам.

В настоящее время методом соматического эмбриогененза размножают более 200 видов растений. Среди древесных таким способом можно размножать осину, эвкалипт, дуб красный и скальный, ель обыкновенную, орех грецкий, липу обыкновенную и крупнолистную.

Для отвердения питательных сред, используемых для индукции соматического эмбриогененза, вместо агара используется гельрит - заменитель агара, природное желирующее вещество, образуемое в процессе ферментации бактериями глюкороновой ксилоты, рамнозы, глюкозы; образует прозрачный, бесцветный гель, широко используемый в микробиологии. Это вещество является дополнительным стимулом индукции эмбриогенеза в соматических тканях и препятствует процессу витрификации эксплантов (оводнению тканей) при длительном их культивировании.

В процессе соматического эмбриогенеза ткани листа претерпевают ряд последовательных изменений. Вначале эксплант увеличивается в размерах и покрывается красными прожилками. Затем начинается интенсивное деление клеток и образуется каллус. Каллусные ткани, как правило, белого цвета, полупрозрачные, через 10... 15 дней они начинают покрываться сферическими узелками разного размера. В это время в каллусной ткани образуются зоны эмбриогенной активности - глобулярные проэмбрио, в тканях которых формируются проэмбриоиды, которые проходят несколько стадий развития (глобулы, сердца, торпеды) с последующим формированием эмбриоидов, которые могут развиваться до полноценного растения.

Ход работы. В ламинар-боксе, соблюдая правила асептики, отделить от растений-регенерантов листья и поместить их на эмбриогенные среды. В течение трех недель проводить наблюдения за изменениями, происходящими с тканями листьев и фиксировать их в тетради, зарисовать стадии изменения растительной ткани и эмбриогенный каллус.

РАБОТА 8

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРВОГО ЭТАПА КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ, ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ

КУЛЬТУР

Материалы и оборудование: культуральные сосуды с эксплантами, лупы, линейки.

Объяснение. Главной задачей первого этапа клонального микроразмножения растений является получение стерильной и хорошо растущей культуры.

Поверхность любой растительной ткани заселена микроорганизмами и их спорами, которые in vitro быстро развиваются, используют питательные вещества среды, выделяя при этом продукты метаболизма, отрицательно действующие на развитие экспланта. Поверхностная стерилизация позволяет освободить эксплант от микроорганизмов, при этом нужно правильно подобрать концентрацию и экспозицию дезинфицирующих растворов, с таким расчетом, чтобы растительная ткань осталась жизнеспособной и не утратила морфогенной активности.

В течение первых 10 дней после введения в культуру экспланты просматривают (не вынимая из культуральных сосудов) и отбирают погибшие в результате жесткой стерилизации и те, на которых отмечено развитие микроорганизмов (грибов или бактерий).

На 14-й день культуры вновь просматривают, определяя их жизнеспособность, при этом обращают внимание на цвет эксплантов, их состояние, наличие изменений ткани. Жизнеспособные экспланты с признаками начала морфогенеза пересаживают на свежую питательную среду того же состава. Последующие пересадки проводят с интервалом в 14...

18 дней. Продолжительность первого этапа составляет 1.. .2 месяца.

На этом этапе можно активизировать рост эксплантов с помощью антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, глютатиона и др.), вводя их вводят в

состав питательной среды, или, соблюдая асептику, выдерживая экспланты в их растворах в течение 4...24 часов. В ряде случаев в питательную среду добавляют адсорбент - древесный активированный угль (0,5...4 %).

Ход работы. Не открывая культуральных сосудов, внимательно рассмотреть с помощью лупы экспланты, введенные в культуру in vitro на предыдущих занятиях методом индукции адвентивных почек непосредственно тканями эксплантов и методом активации имеющихся в растении меристем. Описать их состояние, отметить при этом жизнеспособные культуры, культуры, на которых развиваются микроорганизмы (указать какие) и погибшие (установить причину их гибели). Сделать вывод об эффективности проведенной поверхностной стерилизации, определить процент жизнеспособных культур в эксперименте.

РАЗДЕЛ III

ГРИБОВОДСТВО КАК ОТРАСЛЬ БИОТЕХНОЛОГИИ

Культивируемые грибы выращивают двумя способами: интенсивным и экстенсивным. Интенсивный способ предусматривает использование специализированных помещений с регулируемыми условиями микроклимата и позволяет при коротком технологическом цикле круглогодично получать высокие урожаи.

При экстенсивном культивировании используются отходы лесной промышленности - низкосортная древесина тех пород, на которых этот гриб произрастает в природе, оно проще и дешевле, но урожаи ниже, чем при интенсивном культивировании и отличаются сезонностью, однако, при использовании на плантации штаммов гриба, различающихся сроками плодоношения, можно добиться образования плодовых тел в течение всего сезона с температурой выше 8 С.

Выращивание культивируемых грибов проводится поэтапно.

I этап - получение чистой культуры гриба:

поверхностная стерилизация плодовых тел;

инкубация инокулюма на питательной среде;

отсев мицелия в пробирку и его хранение.

IIэтап - наработка посевного мицелия:

получение мицелиального газона;

выращивание бутылочной культуры;

выращивание пакетной культуры;

контроль качества посевного мицелия.

IIIэтап - подготовка субстрата:

для интенсивного культивирования (в мешках):

выбор субстрата;

пастеризация или ксеротермическая обработка субстрата;

затаривание подготовленного субстрата в мешки;

инокуляция субстрата;

инкубация мицелия.

для экстенсивного культивирования (на брусках древесины):

выбор субстрата;

подготовка отверстий в брусках для внесения посевного мицелия;

инокуляция субстрата;

инкубация мицелия в субстрате.

IV этап - плодоношение и сбор плодовых тел грибов:

условия плодоношения при интенсивном и экстенсивном способе культивирования;