1792

3 Гибридизация соматических клеток

Под гибридизацией соматических клеток понимают слияние соматических клеток. На современном уровне доказано, что можно получать вегетативные гибриды. При слиянии протопластов могут скрещиваться даже разные виды, мешают сливаться целлюлозные оболочки, но есть вещества, которые растворяют оболочки. Например в Японии используют вирус Сендай, его вводят в смешанную культуру двух типов клеток, образуются многоядерные гибридные клетки (гетерокарионы), содержащие в общей цитоплазме ядра обеих родительских клеток. По технике гибридизации вирус Сендай предварительно обрабатывают алкилирующими мутагенами или ультрафеолетовыми лучами, при этом вирус теряет инфекционные свойства, но способен сливать соматические клетки. Большинство многоядерных клеток погибает, но те из них, которые содержат по одному ядру обеих исходных клеток, часто выживают и размножаются делением.

После митоза и деления цитоплазмы из двухядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки (синкарионы), то есть настоящие гибридные соматические клетки, каждая из которых содержит один набор хромосом линии А и один набор хромосом линии В. Получены межвидовые гибриды клеток мыши и человека, крысы и человека, крысы и мыши. Межвидовые гибриды соматических клеток используют для генетического анализа и картирования хромосом человека.

При гибридизации соматических клеток растений разрушение клеточных стенок проводят ферментами, а слияние протопластов добиваются обработкой полиэтиленгликолем. В Канаде, например, получили гибрид двух видов табака, который был похож на половой гибрид. Таким путем получен картофель.

4 Гибридизация на уровне молекул ДНК

Гибридизацией на уровне молекул ДНК занимается генная инженерия. Можно пересадить ген одного организма в другой. Перенос генов при генной инженерии осуществляется не половыми клетками, как при обычном скрещивании, и не ядром, как при соматической гибридизации, а с помощью искусственно создаваемых генетических элементов (векторных молекул), то есть с помощью специально сконструированных плазмид (внехромосомных молекул ДНК, способных к авторепликации и передающиеся в дочерние

клетки при делении бактерий), в геном которых можно внедрить чужеродную генетическую информацию.

В качестве векторов используют кишечную палочку или дрожжи. Таким путем синтезировали инсулин и «прирастили» на ДНК кишечной палочки. Путем генной инженерии получают интерферон. Для растений решается проблема биологической фиксации атмосферного азота, необходимого для ассимиляции.

С помощью ферментов можно «приращивать» почти любые участки ДНК одной клетки и переносить в другие клетки с помощью кишечной палочки или дрожжей.

Генная инженерия применяется для получения генетически модифицированных деревьев, обладающих новыми признаками, которые нельзя получить традиционными способами селекции. К настоящему времени известно несколько подходов повышения продуктивности деревьев

спомощью методов генной инженерии:

1)ускорение прироста древесины путем повышения доступности питательных веществ или переключения метаболизма только на вегетативный рост;

2)улучшение качества древесины;

3)сокращение потерь во время выращивания путем повышения устойчивости к вредителям и болезням;

4)сокращение потерь во время лесозаготовок путем создания растений

снаиболее оптимальными характеристиками габитуса.

Наиболее разработанным подходом является повышение доступности неорганического азота для растений. С этой целью используется ген глутаминсинтазы, который катализирует превращение аммония в глутамин, являющийся предшественником глутамата и всех азотсодержащих компонентов, необходимых для роста растения. Исследования в этом направлении интенсивно ведутся в ряде стран, и полевые испытания трансгенного тополя с усиленной экспрессией глутаминсинтазы, проведенные в Испании, показали на третий год вегетации ускорение в росте на 41 % по сравнению с контролем. В Институте биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН получен ряд трасгенных линий ценных генотипов березы пушистой (Betula pubescens) и осины (Populus tremula) с геном глутаминсинтазы GSI из сосны

обыкновенной. Сейчас проводится анализ экспрессии и отбор перспективных линий.

5 Мутагенез в селекции древесных растений

Мутации – это прерывистые, скачкообразные изменения наследственности, передающиеся по потомству. Этот термин впервые ввел в

науку голландский генетик Гюго де Фриз (1903). Он систематизировал мутации и предсказал, что мутации можно получать искусственно. Мутации вызываются внешними факторами.

Примерами мутаций являются: пирамидальные, плакучие, шаровидные формы тополя черного, каповые формы ореха, сосны, осокоря, ольхи, тополя белого и др.; бесколючковые формы гледичии, шиповника; пестролистные формы у тополя, крушины; рассеченолистные формы у березы, ольхи, бузины и др. Мутации в природе охватывают все признаки дерева. Мутации

–это первоисточник наследственных изменений.

Вклассической генетике выделяют три типа мутаций:

1.Генные или точковые мутации связаны с изменением структуры молекулы ДНК, когда происходит замена или включение одной пары азотистых оснований или выпадение (делеция) нескольких пар.

2.Хромосомные мутации или хромосомные абберации – изменение структуры хромосом. Среди них различают транслокации, когда происходит обмен участками разных хромосом; инверсии, когда определенный участок хромосомы поворачивается на 180◦; делеции – выпадает внутренний участок хромосомы; дупликации – удвоение участка хромосом; нехватка – выпадение небольшого концевого или внутреннего участка хромосомы. Структурные изменения хромосом в большинстве случаев можно обнаруживать под микроскопом.

3.Геномные мутации (перестройки генома) – изменение количества хромосом в два и более раз – полиплоидия; уменьшение диплоидного количества в два раза (гаплоидия), анеуплоидия (уменьшение) или увеличение хромосомного комплекса на одну или большее число хромосом.

Однако С.И. Малецкий и др. (2005) считают, что полиплоидию корректнее обозначать термином «эпигенетическая изменчивость».

Все три мутации – ядерные. Мутации в цитоплазме называются внеядерными или плазмогенными. Мутации, возникающие в гаметах и клетках, из которых они образуются, называются генеративными. Мутации,

происходящие в соматических клетках организма, называются соматическими. По своей природе генеративные и соматичекие мутации, ничем не отличаются. И те, и другие связаны с изменением структуры хромосом, и возникают они примерно с одинаковой частотой. Но по характеру проявления и значимости для эволюции и селекции различия между ними очень существенны. Генеративные мутации при половом размножении передаются следующим поколениям организмов. Доминантные мутации проявляются уже в первом поколении, а рецессивные – только во втором и последующих поколениях, при переходе их в гомозиготное состояние. Соматические мутации возникают в диплоидных клетках, поэтому проявляются только по доминантным генам или по рецессивным генам в гомозиготном состоянии. Они имеют значение для вегетативно размножаемых растений.

Спонтанные или естественные мутации у древесных растений возникают в результате резкого перепада температур, влияния ультрафиолетовых лучей и других внешних факторов. Возникают пестролистные, пирамидальные, полиплоидные и др. формы (рис. 41, 42).

5.1Индуцированные мутации

В1925 г. Г.А. Надсон и Г.Е. Филиппов на бактериях и в 1927 г. Г. Меллер на дрозофиле доказали возможность искусственного получения мутаций путем воздействия лучами Рентгена.

Различают физические и химические мутагены. Физические мутагены вызывают чаще генные мутации. К ним относятся: лучи Рентгена, радия, протоны, нейтроны, ультрафиолетовые лучи, температура, γ – лучи. Считают, что химические мутагены по характеру действия на клетку сильнее

иэффективнее физических мутагенов. Сверхмощные мутагены называют супермутагенами, к ним относятся: колхицин, янтарная кислота, этиленимин, N-нитрозо-N-метилмочевина и др. Применение физических мутагенов: используют специальные установки для облучения семян, черенков, проростков и др.

Способы применения химических мутагенов: замачивание (определенной концентрации и экспозиции); инъекции в почку, тампоны, газовая обработка.

С древесными породами большую работу проводили: в Донецке проф. Ф.Л. Щепотьев (им получен сорт тополя Донецкий золотистый при облучении рентгеновскими лучами тополя волосистоплодного, бесколючковый шиповник, дуб плакучий стелющийся, быстрорастущие дубки), в Новосибирске Г.Ф. Привалов, в Воронеже Е.М. Гуляева получили тетраплоидный тополь бальзамический. Е.М. Гуляевой и др. (1984) получены мутанты тополя бальзамического под воздействием химических мутагенов: N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ), N-нитрозо-N-этилмочевины (НЭМ) и др.

Полученные мутантные формы, индуцированные НЭМ и НММ, представляют собой соматические мутации генного происхождения. Названные выше мутагены обладают высокой мутационной активностью, они могут вызвать крупные и «системные» мутации. Хозяйственно-ценные признаки у тополя бальзамического, индуцированные мутагенами, могут закрепляться при вегетативном размножении, однако, отдельные из них по истечении 20 лет расхимерились.

6 Селекция и размножение полиплоидов

Наследственная изменчивость, связанная с кратным основному увеличением чисел хромосом, обычно называется полиплоидией (от греч. рolyploos – многократный и eidos - вид). Соматические клетки обычно имеют диплоидный набор хромосом, который состоит из пар гомологичных хромосом, полученных от отцовского и материнского организмов. Половые клетки имеют в два раза меньше хромосом, чем соматические, и, следовательно, несут в себе лишь часть наследственной программы. Половинный набор хромосом, имеющийся в половых клетках, называется гаплоидным и обычно обозначается через n. Различают также основной (базисный) набор хромосом (x), У многих организмов основной набор хромосом (x) соответствует количеству хромосом в половых клетках (n).

Полиплоидия широко распространена в природе. Цитологическими исследованиями установлено, что более половины видов покрытосеменных растений – полиплоиды (Гуляев, 1984). Полиплоиды называются и обозначаются по количеству основных наборов хромосом (x), которые содержатся в их клетках: триплоиды (3x), тетраплоиды (4x), пентаплоиды (5x), гексаплоиды (6x) и т.д.

Деревья с увеличенным или уменьшенным количеством хромосом в наборе, некратном гаплоидному (2n-1; 3n+2 и т.д.), называются анеуплоидными (что означает «не настоящая плоидность»).

Полиплоиды различаются в зависимости от способа формирования их хромосомных наборов: от одних и тех же или от разных родительских видов. Первые называются аутоплоидами, вторые - аллополиплоидами. Приставки ауто («сам») и алло- («другие») применяются и при образовании других слов, например аутотетраплоид, аллогексаплоид и др. Аллополиплоидию часто называют еще гибридной полиплоидией. Среди аллополиплоидов наиболее широко известны амфидиплоиды (гибриды с удвоенным числом хромосом). Амфидиплоиды легко размножаются половым путем и часто обладают гетерозисным эффектом.

Изменение нормального числа хромосом может происходить как в соматических клетках тканей, так и в половых клетках. Н.А. Картель и Е.Д. Манцевич (1970) отмечали, если произойдет удвоение числа хромосом в какой-либо одной соматической клетке растения, то полиплоидной будет только та часть растения, которая разовьется из этой клетки, а остальная часть растения будет нормальной. Растение окажется химерным, как и в случае соматической мутации. Это так называемая соматическая полиплоидия или миксоплоидия.

Клетки отдельных дифференцированных тканей растений всегда имеют измененный набор хромосом по сравнению с целым растением. Например, эндосперм покрытосеменных растений обычно триплоидный, а у голосеменных – гаплоидный. Если же полиплоидизация произойдет при первом делении зиготы, то все клетки зародыша окажутся полиплоидными и, следовательно, все развившееся из него растение будет полностью полиплоидным.

Изменение чисел хромосом возможно также и при образовании половых клеток, так нерасхождение всех хромосом в мейозе приводит к образованию гамет с диплоидным набором хромосом, вместо гаплоидного. Из таких гамет при оплодотворении могут появиться растения с тремя и четырьмя наборами хромосом, т.е. триплоиды и тетраплоиды. Среди древесных пород наиболее редки полиплоидные формы у голосеменных и, особенно в семействе сосновых, где обнаружены лишь единичные экземпляры. У покрытосеменных древесных растений полиплоидия

встречается часто, особенно у видов, размножающихся вегетативным путем (тополя, ивы, клены, ольха, береза и др.).

Полиплоидия вызывает значительные изменения признаков и свойств организма. Для лиственных пород наиболее оптимальный триплоидный уровень хромосом, у них клетки крупнее диплоидных, что часто приводит к увеличению размеров отдельных органов и всего растения в целом. Полиплоиды имеют увеличенные листья, почки, цветки, пыльцевые зерна, плоды. Триплоиды интенсивнее растут по высоте и диаметру; например, широко известны гигантские (исполинские) триплоидные формы осины (2n = 57), обнаруженные в Швеции (Нильсон-Эле, 1936), в бывшем Советском Союзе (Яблоков, 1941; Иванников, 1952; Бакулин, 1966; Тамм и Ярвекюльг, 1975; и др.). Триплоидные исполинские осины имеют мощное развитие и высокоценную древесину. Однако обнаруженная С.П. Иванниковым в Обоянском лесхозе Курской области ценная форма осины, цитология которой проверена спустя 40 лет, оказалась диплоидной (Сиволапов и др., 1997).

В1976 году в Хоперском заповеднике Воронежской области обнаружена крупнолистная форма тополя сереющего (Populus canescens Sm.), цитологические исследования которой показали, что в листьях до 74 % триплоидных клеток (Сиволапов, 2005). Этот тополь отличается быстрым ростом и хорошими техническими показателями древесины (рис. 46). На рисунке 47 показана метафазная пластинка соматических тканей тополя Хоперский 1, число хромосом 2n = 2х = 57.

Длина древесинного либриформа в 20 лет достигает 1,6 мм, листья на вершинных годичных побегах достигают 27 см в диаметре, пол женский. Этот тополь обильно цветет и плодоносит, однако семена имеют низкую всхожесть, всходы погибают впервые 2 – 3 недели.

В1976 году в пойме реки Дон (Давыдовский лесхоз) обнаружена исполинская форма тополя сереющего, пол мужской; в возрасте 20 лет в соматической ткани молодых листьев встречалось около 60 % триплоидных клеток. В возрасте 40 лет число триплоидных клеток сократилось до 8 % только в верхней части кроны дерева (Сиволапов, 2005).

Полиплоидия – очень важный фактор в получении новых видов сельскохозяйственных культур, например табака, земляники, ржи, пшеницы, сортов бананов хлопчатника и др. Дж. В. Райт (1978) отмечал, что полиплоидия играет важную роль в получении новых разновидностей лесных

деревьев. Например, каштан конский мясокрасный (4n Aesculus carnea = 2n A. hippocastanum × 2n A. pavia), являющийся аллотриплоидом, возник как самостоятельный вид. Ясень серебристый (2n Fracxinus tomentosa = ? 4n F. americana × 2n F. pensiylvanica) – также преполагаемый аллотриплоидный гибрид. Отобранная А.И. Сиволаповым в Хоперском заповеднике крупнолистная форма тополя сереющего (Populus canescens Sm.) – аллотриплоидный гибрид тополя белого и осины (Сиволапов, 2005). Первый триплоидный дуб черешчатый обнаружен В.В. Иевлевым в Воронежском заповеднике, цитогенетиком А.К. Буториной изучен кариотип этого дерева, в соматической ткани листьев до 70 % триплоидных клеток. Второй триплоидный дуб найден в Шиповом лесу Т.И. Плетминцевой и А.К. Буториной (рис. 48).

Выявлены естественные автотриплоиды у березы бородавчатой, превосходящие по продуктивности обычную диплоидную березу на 36 %. В Швеции найдены два типа триплоидов березы белой. Один из них гибрид от скрещивания березы бородавчатой (2n = 28) и березы пушистой (2n = 56), а другой автотриплоид от диплоидной березы бородавчатой. Во всех случаях триплоиды превосходят диплоидные растения; исключительно перспективны триплоиды у шелковицы белой. Однако тетраплоиды хуже диплоидов. Тетраплоиды обнаружены у ольхи черной и японской, у ясеня белого и клена серебристого. У клена остролистного известна триплоидная форма, а у клена красного даже гекса- и октаплоиды (6х = 78; 8х = 104) (Картель, Манцевич, 1972).

Размножение полиплоидов. Если полиплоиды имеют четный (сбалансированный) набор хромосом, то они фертильны, то есть могут размножаться половым путем (семенами). Например, 4n пшеницу получают семенами, их признаки сохраняются в потомстве. Нечетные полиплоиды размножают вегетативным путем. Триплоидный тополь Э.С. – 38 хорошо размножается зимними черенками, тополь Хоперский 1 размножают культурой in vitro, или зелеными черенками.

6.1 Искусственное получение полиплоидов древесных пород

При нормально протекающем мейозе хромосомное число уменьшается с 2n до 1n. Иногда редукционного деления не происходит, и образуются

яйцеклетки или пыльцевые зерна с 2n хромосомами. Если нередуцированная гамета оплодотворит такую же гамету или нормальную (гаплоидную), в результате образуется полиплоидный эмбрион, который даст начало новой полиплоидной форме.

М.М. Вересиным в 1952 г. от скрещивания тополя канадского (P. deltoids Marsh.) смесью пыльцы тополя белого (P. alba L.), осины (P. tremula L.) и тополя бальзамического (P. balsamifera L.) получен и отобран элитный сеянец 38 (тополь Э.С.-38) – аллотриплоид (миксоплоид) с преобладанием триплоидных клеток (78,4 %). Этот тополь отличается соматическим и адаптивным гетерозисом (рис. 49). В пойме Волги в первый год дает прирост до 5 м. (рис. 50).

Если на меристему растения воздействовать нагреванием или холодом, высушиванием, можно помешать процессу деления хромосом, которые попадают в одну клетку и число их в ней удваивается.

ВЦНИИЛГиС Е.М. Гуляева обрабатывала семена тополя бальзамического 1 % раствором колхицина и получила соматический тетраплоид, а точнее миксоплоид, который при черенковании расхимерили и получили «чистый» тетраплоид. К настоящему времени в возрасте более 30 лет одно сохранившееся дерево высотою около 5 м усыхает, пол не известен.

Наиболее эффективным для искусственного получения полиплоидов оказался метод использования различных химических веществ и особенно колхицина. Он воздействует на механизм расхождения хромосом в процессе митотического деления клеток, удвоившиеся хромосомы, остаются в ядре, образуя тетраплоидную клетку. Колхицин используется чаще всего в виде водных растворов, им обрабатывают семена, проростки, точки роста растений, черенки, цветочные почки и цветки.

В80-х годах прошлого века О.С. Машкиной получена серия мейотических автотриплоидов тополя белого, которые отличаются быстрым ростом и устойчивостью. Триплоидные деревья экспериментально получены путем опыления диплоидных растений тополя белого искусственно синтезированной с помощью повышенной температуры нередуцированной диплоидной пыльцой того же вида (Машкина, 2008).