Exam / Obschaya_mikrobiologia_chast_2

Типы вирусных геномов

КАК ЖЕ ПОНЯТЬ, ЧТО В КУРИНОМ ЭМБРИОНЕ РАЗМНОЖАЕТСЯ ВИРУС?

Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу

В ЧЕМ ЖЕ СОСТОИТ СУЩНОСТЬ ОСНОВНЫХ МЕТОДОВ?

Реакция гемадсорбции (РГАдс):

Берем 2 пробирки (опытную и контрольную). В 1 (опытную) добавляем зараженную вирусом культуру ткани и взвесь эритроцитов, а во 2 (контрольную) – физ. р-р. и взвесь эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Реакцию учитывают под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При

вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на зараженных вирусом клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания.

Реакция гемагглютинации (РГА):

Основана на способности некоторых вирусов вызывать за счет вирусных гемагглютининов агглютинацию (склеивание) эритроцитов. На предметное стекло наносят 2 капли взвеси эритроцитов. В 1 (опытную) добавляют вируссодержащий материал (аллантоисную жидкость), а во 2 (контрольную) – каплю физ. р-ра.

Реакция преципитации в агаре (РП):

На предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлаждённого агара, толщиной слоя около 1 мм. После застывания вырезают 4 лунки, в которые наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая

сыворотка, специфический АГ, нормальная сыворотка, искомый АГ. Если искомый АГ соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципитации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим АГ. Реакция наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной камере.

Реакция связывания комплемента (РСК):

Реакция заключается в том, что при соответствии друг другу АГ и АТ они образуют иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С), и

образуется комплекс: КОМПЛЕМЕНТ- АНТИГЕН-АНТИТЕЛО.

Реакцию РСК ставят в 2 этапа:

1.Инкубация смеси, содержащей: АГ + АТ + Комплемент (С)

2.Индикаторная: добавляют гемолитическую систему (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка, содержащей АТ к эритроцитам) для выявления свободного комплемента. (подробнее в следующей итоговой)

Метод цветных проб:

На суспензии клеток с питательной средой добавляем индикатор и вносим в 2 пробирки (опытную и контрольную). Обе пробирки поверх питательной среды заливают вазелиновым маслом (создаем анаэробные условия). В анаэробных условиях физиологически активные клетки выделяют органические кислоты и индиктор изменяет окраску среды, а если клетки погибают под действием вируса, то цвет среды не изменяется.

Метод бляшек:

В специальном флаконе на стенке выращивают монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром,

содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону, и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды не изменится и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек разной формы и величины, что зависит от вида вируса.

Иммунофлуоресцентный метод (метод флуоресцирующих АТ):

Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках, затем препарат промывают в физ. р-ре., подсушивают и фиксируют в ацентоне при 4 ºС в течение 10 мин. Далее препарат окрашивают специфической флуоресцирующей сывороткой при 37ºС в течение 30 мин. После

промывают в физ. р-ре., высушивают и просматривают с помощью

люминисцентного микроскопа. В местах локализации вируса – свечение.

Цитопатический эффект

Это дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса

ЧТО ТАКОЕ ТИПИРОВАНИЕ ВИРУСОВ И КАКИЕ МЕТОДЫ СУЩЕСТВУЮТ?

МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ:

ЭТАПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ:

1. Адсорбция:

Гликопротеин или белок оболочки взаимодействует с вирусным рецептором на поверхности клетки. Взаимодействие может быть специфичным (например, вирусы гепатита поражают только гепатоциты).

2. Проникновение вируса в клетку путём:

Эндоцитоза – типично для простых нуклеокапсидных вирусов

Слияния мембран – типично для вирусов с суперкапсидом, при этом, один из поверхностных белков (белок слияния) взаимодействует с липидным бислоем клетки, в результате липидные бислои вируса и клетки сливаются в общую мембрану и нуклеокапсид переходит внутрь клетки, а оболочка вириона остается на поверхности клетки.

3. Освобождение нуклеиновых кислот – «РАЗДЕВАНИЕ».

Разрушение капсида и активация нуклеиновой кислоты.

4. Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство НК и белков вируса.

5. Самосборка вирионов – ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.

Простые вирусы – САМОСБОРКА:

нуклеиновая кислота + капсидные белки.

Сложные вирусы: образование нуклеокапсида → «Одевание» оболочки из мембраны клетки-хозяина.

У некоторых под оболочкой формируется белковый М-слой.

6. Выход вирусных частиц из клетки следующими способами:

Почкование – клетка-хозяин может остаться жизнеспособной:

1)Нуклеиновая кислота и капсидный белок вируса собираются в нуклеокапсид

2)Белки-предшественники гликопротеинов проходят через ЭР и аппарат Гольджи

3)Зрелые гликопротеины встраиваются в плазматическую мембрану клеток, вытесняя гликопротеины хозяина

4)Нуклеокапсид взаимодействует с гликопротеинами и образуется комплекс, подвергающийся экзоцитозу.

Цитолиз – сопровождается гибелью клетки:

1)Сборка завершается в ядре или цитоплазме клетки-хозяина

2)Вирус нарушает жизнедеятельность клетки и приводит к ее гибели (некротическая гибель)

3)Клеточные ферменты разрушают ЦПМ

4)Вирус выходит во внеклеточную среду.

МЕХАНИЗМЫ ПЕРСИСТИРОВАНИЯ ВИРУСОВ В ОРГАНИЗМЕ:

Что же может произойти, когда вирус окажется в клетке организма?

ЧТО ТАКОЕ ПРОТООНКОГЕН И ОНКОГЕН?

ФОРМЫ ОБМЕНА ГЕНЕТИЧЕСКИМ МАТЕРИАЛОМ У БАКТЕРИЙ:

1.Трансдукция – передача генетического материала от донора реципиенту при помощи бактериофага. При этом формируются дефектные фаги, не способные к продуктивному процессу, и бактерия с новыми свойствами.

Трансдукция может быть: 1) Неспецифической – передаётся любой ген

2)Специфической – только 1 определенный ген (например, lac+).

2.Конъюгация – передача генетического материала от бактерии-донора бактерии-реципиенту посредством прямого контакта через F-пили (половая пиль)

3.Трансформация – передача генетического материала при помощи изолированной ДНК

4.Трансфекция – трансформация фаговой ДНК.

5.Сексдукция – перенос генов от донора реципиенту при помощи F'-фактора.

РАССМОТРИМ МЕХАНИЗМЫ ТРАНСДУКЦИИ И КОНЪЮГАЦИИ:

1. Адгезия бактериофага на поверхности бактерии-донора с последующим проникновением 2. Размножение бактериофага внутри клетки

3. Самосборка фаговых частиц и образование дефектного бактериофага (сохраняет инфекционные свойства и содержит какой-либо фрагмент ДНК бактерии донора)

4. Перенос дефектным бактериофагом включенной ДНК в клетку-реципиент

5. Рекомбинация и включение перенесенной ДНК в клетку-реципиент, а следовательно, изменение ее свойств.

1.В процессе конъюгации донорная клетка образует F-пили (половая пиль, плазмида) (1-2 из общего количества ворсинок).

2.Прикрепление F-пили к клетке-реципиенту.

3.Образование прямого контакта посредством цитоплазматического мостика (канала), через который осуществляется перенос ДНК.

4.Когда реплицируется весь F-фактор (плазмида) и передастся в реципиентную клетку, происходит достройка второй нити и замыкание кольцевидной двунитиевой F- плазмиды. Исходная F-плазмида остается в донорной клетке.

5.Результат: в клетку-реципиент переходит F- плазмида, и клетка становится новым донором.

ЧТО ТАКОЕ ПЛАЗМИДЫ И КАКИМИ ОНИ БЫВАЮТ?

ПЛАЗМИДЫ – наипростейшие автономные организмы, лишенные оболочки, собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и представляющие собой особый класс абсолютных внутриклеточных паразитов, наделяющих своих бактерий-хозяев полезными для них свойствами.

Бывают следующих видов:

F-плазмиды – контролируют синтез F-пилей и передачу генетического материала от бактерий-доноров (F+) к бактериям-реципиентам (F-) в процессе конъюгации.

Плазмиды бактериоциногении (Col – плазмиды) – кодируют синтез бактериоцинов – белковых продуктов, вызывающих гибель бактерий того же или близких видов (антогонист бактерий)

R-плазмиды – кодируют устойчивость к лекарственным препаратам

Плазмиды патогенности – контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование.

-Hly-плазмиды – кодируют синтез гемолизина

-Ent-плазмиды – кодируют синтез энтеротоксина

-Tox-плазмиды – кодируют синтез экзотоксина

Плазмиды биодеградации – кодируют способность утилизировать органические соединения (углеводородные, циклические, ароматические) в качестве источника углерода и энергии.

Криптические плазмиды – биологические функции неизвестны.

КТО ТАКИЕ БАКТЕРИОФАГИ?

БАКТЕРИОФАГИ – вирус, который паразитирует (размножается) в определенных видах бактерий.

Состоит из следующих компонентов:

Головка – икосаэдр, содержит геном,

представленный двунитиевой линейной ДНК;

Головка связана с помощью воротника и зонтика с хвостиком.

Хвостик: содержит полый стержень внутри, заканчивающийся шестиугольной пластинкой (базальной) с 6 шипами.

Хвостик имеет белковый чехол, состоящий из 144 субъединиц, и образующий 24 спирали; (каждая белковая молекула содержит 1 молекулу АТФ-азы и ион Ca^2+). Белок актиноподобный и способен сокращаться.

В пластинке и шипах содержится лизоцим, участвующий в растворении клеточной стенки. Хвостик имеет 6 ворсинок;

У неактивного фага они свернуты и сложноэфирными связями прикреплены к белкам чехла. А в момент абсорбции (активный фаг) они раскрываются и обеспечивают плотное прикрепление фага к бактериальной клетке.

Вирулентным бактериофаг – способен вызывать продуктивную форму инфекции. Умеренный бактериофаг - способен вызывать интегративный процесс

БАКТЕРИОФАГ МОЖЕТ ВЫЗВАТЬ СЛЕДУЮЩИЕ ТИПЫ ИНФЕКЦИЙ:

СТАДИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ Т-ЧЁТНОГО ФАГА С БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКОЙ:

1. Адсорбция фагов на поверхности бактерии при помощи специфических рецепторов (белковлоцманов), которые располагаются на кончике нити, шипа или хвоста.

2. Проникновение фагового генома через клеточную стенку и ЦПМ внутрь клетки и освобождение его от оболочки («раздевание»).

3. Установление фагового генома с помощью белка-лоцмана для реализации содержащейся в геноме информации.

4. Репликация фаговой геномной ДНК или РНК

5. Сборка вновь синтезируемых вирионов

6. Выход вновь синтезированных фагов из клетки:

а) Путем отпочковывания б) Путем лизиса клетки изнутри

БАКТЕРИОФАГИ ШИРОКО ИСПОЛЬЗУЮТСЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ:

1.Выпускаются препараты дизентерийного, сальмонеллезных, коли-протейного, стафилококкового и др. бактериофагов, которые применяются для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, вызванных антибиотикорезистентными бактериями.

В каждом случае предварительно определяют чувствительность выделенных возбудителей к данному препарату бактриофага.

2.Применяются с эпидемиологическими целями для установления источника инфекции.

Фаготипирование – метод, позволяющий определить видовую принадлежности исследуемой культуры и её фаготип, а также установить источник инфекции и пути её передачи.

(Т.к. у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго определенные

фаги, которые затем вызывают лизис)

В эпидемиологии реакция нарастания титра.

Преимущества БАКТЕРИОФАГОВ перед АНТИБИОТИКАМИ

1.Строгая специфичность (воздействуют на 1 вид бактерий)

2.Саморегуляция (если нет чувствительных бактерий, удаляются из организма)

3.Полная совместимость с другими лекарственными препаратами

4.Самовоспроизведение (действуют до момента полного исчезновения бактерий)

5.Безопасность (можно маленьким детям и беременным)