D |
|
|
|
|
|
|
0,6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
|
|
|
|
0,5 |
|
|
|
|
|
|
0,4 |
|
|
|
|
|
|
0,3 |
1 |
|
|
|
|
|
0,2 |
|
|
|
|
|
|
0,1 |
|
|
|
|
|
|
|
370 |
39 0 |
41 0 |
43 0 |
45 0 |
, нм |
Рисунок 225 - |
Дифференциальные спектры поглощения водно-спиртого извлечения из |
травы тимьяна ползучего с алюминия хлоридом (1) и цинарозида с алюминия хлоридом |
(2) |
в видимой области спектра |
|
|
|
|
При измерении оптической плотности применен вариант дифференциальной спектрофотометрии, при котором для сравнения было использовано исходное извлечение без добавления раствора алюминия хлорида. В результате чего было исключено влияние сопутствующих веществ,
содержащихся в исследуемом извлечении и оптическая плотность которых находится в области максимума поглощения данного извлечения [78, 123, 283].
Для улучшения воспроизводимости результатов, к анализируемым пробам прибавляли кислоту уксусную для переведения флавоноидов в недиссоциированную форму. При изучении устойчивости окрашивания извлечений из сырья чабреца, которое образуется в результате реакции комплексообразования с алюминия хлоридом, установлено, что оно наступает через 30 минут анализа и является устойчивым в течение 2-х часов. Это время являетя достаточным для проведения количественного анализа флавоноидов
(таблица 37).
Таблица 37 – Определение устойчивости окраски водно-спиртового извлечения из сырья тимьяна ползучего с алюминия хлоридом
Время проведения |
Оптическая плотность, λmax=395 нм |
реакции, минуты |
|
20 |
0,489 |
|
311 |
30 |
|
0,550 |
|
60 |
|
0,550 |
|
90 |
|
0,550 |
|
120 |
|
0,550 |
|
В результате |
проведенных исследований была разработана методика |
определения суммы флавоноидов в пересчете на цмнарозид.
Методика спектрофотометрического определения флавоноидов
Выделенную аналитическую пробу сырья чабреца измельчают и просевают сквозь сито с размером отверстий 2,0 мм. Точную навеску (около 1,0
г) подготовленного сырья помещают в колбу вместимостью 250,0 мл,
приливают 100,0 мл спирта этилового 70%, далее взвешивают с погрешностью
0,01 г. Колбу соединяют с обратным холодильником, помещают в кипящую
водяную баню и нагревают в течение 60 минут, колбу периодически
встряхивают для смывания частиц сырья со стенок колбы. По истечении времени содержимое колбы охлаждают искусственно, взвешивают и если есть необходимость до первоначальной массы доводят спиртом этиловым 70%. Полученное извлечение фильтруют через бумажный складчатый фильтр, при этом отбрасывают первые 10,0 мл фильтрата.
В мерную колбу объемом 25,0 мл, помещают 2,5 мл полученного извлечения, приливают 5,0 мл раствора алюминия хлорида 5% в спирте эти-
ловом 70%, выдерживают 10 минут и далее приливают 1,0 мл раствора кислоты уксусной 3%. Объем полученного раствора доводят спиртом этиловым 70% до метки и оставляют на 30 минут. Далее проводят измерение оптической плотности полученного раствора на спектрофотометре в кювете с толщиной рабочего слоя 10,0 мм при длине волны 395 нм.
В качестве раствора сравнения выступает раствор, состоящий из 2,5 мл исходного извлечения, 1,0 мл раствора кислоты уксусной 3% и доведенный спиртом этиловым 70% до метки в мерной колбе вместимостью 25,0 мл (Приложение №5).
Содержание суммы флавоноидов в процентах (Х) рассчитывают по формуле в пересчете на цинарозид:
D х 100 х 25 х 100
Х =
345 х V х m х (100-W)
где D – оптическая плотность исследуемого раствора при длине волны 395 нм;
345 – удельный показатель поглощения цинарозида с алюминия хлоридом в спирте этиловом 70%;
V – количество извлечения, в мл;
m – масса навески сырья, в граммах;
W – влажность сырья, %
Валидационные характеристики методики спектрофотометрического
определения флавоноидов
Валидационные характеристики методики спектрофотометрического определения флавоноидов были определены по показателям: линейности,
диапазону пользования, повторяемости, воспроизводимости и правильности.
Для определения линейности использовали 6 уровней концентраций.
Первоначально был приготовлен раствор стандартного образца цинарозида
(0,05%), а далее его разбавляли с получением растворов различных концентраций, для чего в мерные колбы объемом 25,0 мл брали по 0,25; 0,5; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50 исходного стандартного образца цинарозида, приливали в каждую колбу по 5,0 мл 5% раствора алюминия хлорида в спирте этиловом
70%, оставляли на 10 минут и далее приливали 1,0 мл 3% раствора кислоты уксусной; содержимое колб перемешивали и доводили спиртом этиловым 70%
объем раствора до метки и еще раз перемешивали. По истечении 30 минут была измерена оптическая плотность полученных растворов цинарозида на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10,0 мм в области максимума поглощения (395 нм). Градуировочный график цинарозида представлен на рисунке 226.
313
нм 1,2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,8 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
D |
0,6 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,0005 |
0,001 |
2 |
0,0015 |
3 |
0,002 |
4 |
0,0025 |
5 |
0,003 |
6 |
|
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
С |
|
|
|
|
мг/мл |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Рисунок 226 - Зависимость оптической плотности приготовленных растворов от |
концентрации цинарозида |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Критерий приемлемости линейности выражается коэффициентом корреляции. Если величина коэффициента корреляции близка к единице, то полученные данные можно отобразить в виде прямой линии (рисунок 226).
Таблица 38 - Статистическая обработка результатов исследований,
полученных при изучении линейности методики
|
F |
_ |
_ |
b |
a |
R |
|
x |
y |
|
|
|
|
|
|
4 |
0,00175 |
0,603017 |
378,7029 |
-0,05971 |
0,999614 |
При статистической обработке данных установлен коэффициент корреляции, который составил 0,999614, что близко к единице (таблица 38). В
связи с чем разработанная спектрофотометрическая методика может быть использована для анализа флавоноидных соединений травы тимьяна ползучего в пересчете на цинарозид в указанном диапазоне концентраций.
Проверку диапазона использования методики проводили следующим образом: получали водно-спиртовые извлечения различной концентрации, для чего брали различные навески сырья чабреца 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 г и из них готовили извлечения на спирте этиловом 70% по разработанной нами методике.
В мерные колбы объемом 25,0 мл приливали полученне извлечения по 2,5 мл,
314
далее прибавляли по 5,0 мл алюминия хлорида 5% раствора в спирте
этиловом 70%, содержимое колб перемешивали и объем раствора доводили до метки спиртом этиловым 70% и еще раз перемешивали. По истечении 30 минут измеряли на спектрофотометре оптическую плотность полученных растворов при длине волны 395 нм, в кювете с толщиной слоя 10,0 мм на фоне исходного извлечения без алюминия хлорида.
Зависимость оптической плотности растворов (Y) от массы навески сырья
(X) приведена на рисунке 227 и выражается уравнением Y=A+BX, где А – |
- |
0,01758, В – 0,536, коэффициент корреляции R=0,998032. |
|
Результаты проведенных исследований позволили установить, что зависимость оптической плотности раствора (от 0,3 до 0,7) от концентрации в диапазонах исследуемых концентраций является линейной (рисунок 227).
н |
0,7 |
|
|
|
|
|
0,6 |
|
|
|
|
|
0,5 |
|
|
|
|
|
0,4 |
|
|
|
|
D |
0,3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
0,2 |
|
|
|
|
|
0,1 |
|
|
|
|
|
0 |
|
|
|
|
|
0,4 |
0,6 |
0,8 |
1 |
1,2 |
|
|
|
С |
|
Г |
Рисунок 227 - График зависимости оптической плотности извлечения травы тимьяна
ползучего от концентрации
Кроме того, найденное значение коэффициента А (-0,01758)
свидетельствует о статистически незначимом вкладе других фенольных соединений, содержащихся в сырье и полученном извлечении, в содержание флавоноидов, что позволяет сделать вывод что разработанная методика достаточно специфична.
Для определения повторяемости методики брали один образец сырья и проводили исследование в 6 повторностях. Определяли величину относительного стандартного отклонения, которая не должна превышать 10%.
Эта величина составила 4,43% (таблица 39).
Таблица 39 - Результаты определения флавоноидов в траве тимьяна ползучего с использованием дифференциальной спектрофотометрии
№п/п |
Содержание флавоноидов, % |
Метрологическая характеристика |
1 |
1,34 |
Хср.=1,350 |
2 |
1,39 |
Sx2=0,000590 |
3 |
1,38 |
Sxср=0,0242 |
4 |
1,35 |
X=0,06 |
5 |
1,33 |
Eотн=4,43% |
6 |
1,34 |
Хср±ΔХср=1,35±0,06 |
Для определения воспроизводимости методики брали 3 образца сырья и исследовали в трех повторностях двумя исследователями (таблица 40).
Определяли величину относительного стандартного отклонения, которая не должна превышать 15%.
Таблица 40 – Результаты определения воспроизводимости разработанной методики
Повторность |
Содержание флавоноидов в пересчете на цинарозид в сырье |
|
|
тимьяна ползучего, % |
|
|
Аналитик 1 |
Сырье 1 |
Сырье 2 |
Сырье 3 |
1 |
|
1,37 |
0,98 |
1,39 |
2 |
|
1,34 |
0,96 |
1,45 |
3 |
|
1,31 |
0,97 |
1,41 |
4 |
Аналитик 2 |
1,33 |
0,99 |
1,44 |
5 |
|
1,35 |
0,96 |
1,42 |
6 |
|
1,36 |
0,98 |
1,41 |
Среднее значение |
1,34 |
0,97 |
1,42 |
Относительное стандартное |
4,20 |
3,35 |
3,97 |
отклонение, (RSD%) |
|
|
|
Проведенные нами исследования показали, что данная величина не превышает 4,20%, что свидетельствует о том, что разработанная методика воспроизводима в указанных условиях.
При определении правильности методики устанавливали содержание флавоноидов в пересчете на цинарозид в извлечениях, полученных при добавлении определенного количества 0,25 мл, 0,50 мл, 0,75 мл стандартного раствора цинарозида к полученному нами извлечению для получения различных концентраций. Критерием приемлемости методики является величина среднего процента восстановления при применении растворов определенных концентраций, скорректированная на 100%. Средняя величина критерия приемлемости определяется рамками 100±5%. [95].
Таблица 41 – Результаты определения правильности методики (эксперименты с добавками цинарозида)
№ |
Содержание |
Добавлено |
Ожидаемое |
Полученное |
Полученн |
Статистические |
п/п |
флавоноидов |
ГСО |
содержание, |
содержание, |
ая |
характеристики |
|
мг, в |
цинарозида, |
мг |
мг |
ошибка, |
|
|
пересчете на |
мг |
|
|
% |
|
|
цинарозид |
|
|
|
|
|
1 |
0,375 |
0,125 |
0,500 |
0,493 |
98,60 |
Xср =100,48 |
2 |
0,375 |
0,125 |
0,500 |
0,491 |
98,20 |
S2 = 3,327654 |
3 |
0,375 |
0,125 |
0,500 |
0,513 |
102,60 |
S = 1,81012 |
4 |
0,375 |
0,250 |
0,625 |
0,623 |
99,68 |
x = 4,18 |
5 |
0,375 |
0,250 |
0,625 |
0,637 |
101,92 |
Eотн = 4,16% |
6 |
0,375 |
0,250 |
0,625 |
0,645 |
103,20 |
|
7 |
0,375 |
0,375 |
0,750 |
0,751 |
100,13 |
|
8 |
0,375 |
0,375 |
0,750 |
0,742 |
98,93 |
|
9 |
0,375 |
0,375 |
0,750 |
0,758 |
101,07 |
|
|
|
|
Средняя ошибка 100,48% |
|
|
Проведенные исследования показали, что процент восстановления в разработанной методике варьирует от 98,20% до 103,20%, при этом средняя величина его составила 100,48%.
Как видно из данных, приведенных в таблице 41 в разработанной методике отсутствует систематическая ошибка, относительная ошибка при доверительной вероятности 95% не превышает 4,16%.
Результаты проведенных исследований позволили установить, что разработанная спектрофотометрическая методика достаточно воспроизводима,
линейна в исследуемом диапазоне концентраций, непродолжительна по
времени выполнения, доступна, для ее выполнения не требуется
дорогостоящих реактивов [59].
Разработанную методику использовали для анализа 5 партий сырья тимьяна ползучего, а также травы всех изучаемых видов тимьянов (таблицы 42-
45).
Таблица 42 - Определение флавоноидов в траве исследуемых видов тимьяна
(n=5)
Наименование |
Место и год |
Метрологические характеристики методики |
тимьяна |
заготовки |
_ |
|
S_ |
|
|
|
сырья |
х,% |
Sx2 |
x |
Eотн. |
|
тимьяна |
|
|
x |
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
|
|
|
|
|
|
Тимьян |
Воронежская |
1,24 |
0,00037 |
0,01924 |
0,05 |
4,03 |
Палласа |
обл., 2012 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Белгородская |
1,01 |
0,00017 |
0,01304 |
0,04 |
3,96 |
|
обл., 2012 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Тимьян |
Белгородская |
1,43 |
0,00043 |
0,02074 |
0,06 |
4,20 |
меловой |
обл., 2011 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Воронежская |
1,12 |
0,00037 |
0,01924 |
0,05 |
4,46 |
|
обл., 2011 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Тимьян |
ООО Фирма |
0,98 |
0,00025 |
0,015811 |
0,04 |
4,49 |
ползучий |
«Здоровье» |
|
|
|
|
|
Тимьян |
Брянская |
2,43 |
0,00082 |
0,02864 |
0,08 |
3,29 |
блошиный |
обл., 2012 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Курская обл., |
2,10 |
0,00035 |
0,01871 |
0,05 |
2,38 |
|
2012 |
|
|
|
|
|
Тимьян |
Орловская |
1,11 |
0,00017 |
0,01304 |
0,04 |
3,60 |
Маршалла |
обл., 2011 |
|
|
|
|
|
|
Орловская |
1,56 |
0,0005 |
0,02236 |
0,06 |
3,85 |
|
обл., 2012 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Белгородская |
1,16 |
0,00022 |
0,01483 |
0,04 |
3,45 |
|
обл., 2011 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Курская обл., |
1,49 |
0,00013 |
0,0114 |
0,03 |
2,01 |
|
2013 |
|
|
|
|
|
|
Тимьян |
Курская обл., |
|
|
|
|
|
|
двуликий |
2013 |
0,81 |
0,00015 |
0,012247 |
0,03 |
4,20 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Курская обл., |
0,86 |
0,00025 |
0,01581 |
0,04 |
4,65 |
|
|
2014 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Тимьян |
Курская обл., |
1,33 |
0,00037 |
0,01924 |
0,05 |
3,76 |
|
Черняева |
2014 |
|
|
|
|
|
|
Приведенные результаты показали, что содержание флавоноидов в траве тимьяна ползучего варьирует от 0,94% до 1,64% (таблицы 43-45). В связи с чем была установлена норма содержания суммы флавоноидов в траве чабреца не менее 0,9%. В траве же других исследованных растений (таблица 42)
содержание флавоноидов колеблется от 0,81% до 2,43%. Наибольшее содержание флавоноидов отмечено у тимьяна блошиного. Все исследуемые растения рода тимьян удовлетворяют требования ФС «Чабреца трава» по содержанию флавоноидов, кроме тимьяна двуликого, у которого содержание колеблется от 0,81% до 0,86%, что тоже близко к требованиям фармакопейной статьи на траву чабреца.
5.2Установление числовых показателей
Внормативную документацию на растительное сырье обязательно входит раздел «Числовые показатели» (содержание экстрактивных веществ,
влаги, золы общей и не растворимой в 10% растворе кислоты,
Таблица 43 - Результаты определения числовых показателей травы чабреца (цельное сырье)
N |
Место и |
Фаза |
Мас- |
Дата |
Содерж |
Содерж |
Содер- |
Влаж- |
Зола, % |
Кусочков |
Измельчен- |
Органи- |
Мине- |
Радио- |
п/п |
дата сбо- |
ве- |
са |
ана- |
ание |
ание |
жание |
ность |
|
|
стеблей |
ных частиц, |
ческой |
раль- |
нукли- |
|
ра сырья |
гета- |
пар- |
лиза |
экстракт |
экстракт |
суммы |
% |
|
Нераст- |
толщиной |
проходящих |
при- |
ной- |
ды, |
|
|
тации |
тии, |
|
ивных |
ивных |
флавоно |
|
Общая |
более 0,5 |
сквозь сито с |
меси, |
примес |
Бк/кг |
|
|
|
кг |
|
в-в, |
в-в, |
идов, % |
|
|
вори- |
мм, % |
размером |
% |
и |
|
|
|
|
|
|
|
мая |
|
|
|
|
|
|
извлекае |
извлекае |
|
|
% |
|
отверстий |
|
% |
|
|
|
|
|
|
|
|
в 10% |
|
|
|
|
|
|
|
|
мых |
мых |
|
|
|
|
3 мм, % |
|
|
|
|
|
|
|
|
водой,% |
спиртом |
|
|
|
НCl, % |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
30% |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1 |
Курская |
Цве- |
1,8 |
I-2012 |
22,51 |
21,45 |
1,34 |
7,75 |
5,46 |
3,72 |
8,35 |
4,20 |
0,95 |
0,62 |
136,29 |
|
область, |
тение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
окр. г. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Курска, |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
VII-2006 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2 |
Белгород- |
Цве- |
2,0 |
I-2012 |
24,08 |
23,62 |
1,42 |
10,60 |
10,21 |
4,36 |
9,18 |
3,18 |
0,73 |
0,54 |
118,40 |
|
ская |
тение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
обл., окр. |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
г.Белго- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
рода, |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
VII-2006 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3 |
ЗАО |
Цве- |
2,5 |
I-2012 |
20,83 |
19,93 |
0,98 |
9,86 |
11,38 |
3,84 |
7,23 |
4,45 |
0,90 |
0,68 |
143,52 |
|
фирма |
тение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
«Здоро- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
вье» VII- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2006 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
