Сизенцов А.Н. Общая вирусология с основами таксономии вирусов позвоночных
.pdfБиологические особенности. Распространяются алиментарно и аэрозольно;
членистоногих переносчиков нет. Отмечается специфичность по отношению к есте-
ственным хозяевам (бабуины, летучие мыши, птицы, КРС, человек, обезьяны, овцы,
свиньи, змеи). Распространены повсеместно. Ортореовирусы человека, как правило,
авирулентны, но могут вызывать заболевания верхних дыхательных путей и энтери-
ты у детей. У мышей ортореовирусные инфекции сопровождаются диареей, замед-
лением развития, синдромом жирных волос, гепатитами, желтухами, миокардитами,
миозитами, пневмониями, энцефалитами и неврологическими симптомами. У до-
машних животных инфекция сопровождается поражением дыхательных путей и диареями. У обезьян инфекция проявляется развитием гепатита, билиарной атрезии,
менингитов, некрозов эпендимы и эпителиальных клеток хороидального сплетения.
Изолят BRV был выделен от бабуинов с менингэнцефаломиелитом, а изоляты от змей – от животных с признаками неврологических расстройств. Птичьи ортореови-
русы не инфицируют млекопитающих. Исход болезни у птиц варьирует от инаппа-
рантной формы, до летального, что зависит от штамма вируса и возраста птицы.
При развитии системной инфекции вирус выделяется из многих тканей. У цыплят болезнь проявляется нарушением оперения, гастроэнтеритами, гепатитами, миокар-
дитами, пневмониями, потерей веса, слабым ростом, гибелью. У индеек ортореови-
русная инфекция проявляется в виде энтеритов. У птиц, перенесших острую сис-
темную инфекцию, развивается теносиновит, напоминающий патологию ревмато-
идного артрита у людей.
Критерии подразделения на виды внутри рода. Ортореовирусы включают 4
вида и 2 неклассифицированных вируса. Определяющим критерием для классифи-
кации по видам является прямое доказательство обмена генетическим материалом путем реассортации сегментов генома. На данный момент нет сведений о реассор-
тации между четырьмя видами.
Представители данного рода могут быть идентифицированы по следующим признакам:
· способность к обмену генетическим материалом путем реассортации -сег ментов генома во время коинфекции, продуцируя жизнеспособные вирионы;
411
·идентификация консервативных терминальных сиквенсов геномных РНК внутри вида (абсолютная консервативность от 4 bр до 8 bр 5'- и 3'-концов);
·идентификация идентичности сиквенсов между протеинами, кодируемыми гомологичными геномными сегментами (более 85 % идентичности по аминокисло-
там внутри вида и 65 % – между видами);
·идентификация идентичности сиквенсов между гомологичными сегментами генома (более 75 % идентичности внутри вида и 60 % – между видами);
·идентификация серотипа вируса (на основе перекрестной нейтрализации) с
вирусным типом, уже классифицированным в качестве вида данного рода;
·демонстрация широкого антигенного сходства по мажерным структурным протеинам внутри вида, с использованием ELISA и иммунопреципитации;
·анализ электрофоретипа с помощью AGE, но не PAGE (некоторое сходство может быть между близкородственными видами);
·сходная организация полицистронных геномных сегментов;
·идентификация хозяина и клинические признаки.
На основе анализа аминокислотных сиквенсов протеина ст2 (мажерный, внут-
реннего капсида) 4 вида ортореовирусов можно подразделить на 3 подгруппы. Под-
группа 1 включает все нефузогенные изолятыMRV, представленные одним видом
MRV и подразделяемые на серотипы. Подгруппу 2 составляют два вида, представ-
ленных многочисленными изолятами ARV, выделенными от промышленной птицы
(включая несколько серотипов), и NBV (выделенным только однажды от летучих лис). Аминокислотная идентичность по протеину классаS между этими двумя ви-
дами составляет от 40 % до 60 %, идентичность по гомологичным протеинам между подгруппами составляет от 20 % до 30 %, между изолятами внутри вида – 90 %. Два данных вида, образующих синцитий, более близки в антигенном отношении между собой, чем по отношению к другим видам, обладают сходным консервативным кон-
цевым сиквенсом сегментов генома и проявляют сходство в организации полицис-
тронного, индуцирующего слияние (fusion-inducing), геномного сегмента S1. По си-
квенсной дивергенции и неспособности к реассортации изолятыARV и NBV под-
412
разделяются в отдельные виды в пределах одной подгруппы.
Третья подгруппа представлена одним видомBRV. Этот изолят также вызы-
вает образование синцития, но имеет небольшое сходство по сиквенсу(от 20 % до
30 %) и антигенным свойствам с другими фузогенными видами. ВRV также содер-
жит полицистронный геномный сегментS4, эквивалентный сегменту S1, с отли-
чающейся организацией гена, протеин слияния, не имеющий сходства с аналогом
ARV и NBV, и уникальный консенсусный сиквенс по 5'-концу.
Два неклассифицированных вируса, выделенных от змей, также способные индуцировать слияние клеток, но не имеющие электрофоретического профиля ге-
номного сегмента, сходного с таковым уARV и BRV. Ndelle virus (NDEV) ранее обозначался как неклассифицированный орбивирус, однако анализ генома показал высокую степень гомологии сMRV, как минимум, по четырем геномным сегмен-
там. В настоящее время официально зарегистрировано 4 основных и 3 предполагае-
мых вида.
Род: Orbivirus
Типовой вид: Bluetongue virus (BTV) (вирус блютонга).
Характерные особенности. Вирион имеет капсид без особых характерных признаков. Геном представлен 10 сегментами двуспиральной РНК. Коровью части-
цы имеют характерные кольцевидные капсомеры. Репликация сопровождается про-
дукцией вирусных «трубочек» (tubules) и вирусных телец-включений; мажерный внешний коровый протеин(VP7(T13)) может формировать в цитоплазме клеток плавучие гексагональные кристаллы.
Распространение вируса происходит с участием различных кровососущих членистоногих.
Морфология. Вирион BTV икосаэдральной симметрии, но может выглядеть сферическим; диаметр 80 нм; коровые частицы имеют максимальный диаметр
73 нм, субкор имеет максимальный диаметр59 нм и внутренний диаметр46 нм.
Зрелый вирион не имеет липидной оболочки. Выход из клетки осуществляется через плазматическую мембрану, при этом может формироваться липидная оболочка, ко-
торая вскоре теряется. Неочищенные вирионы часто ассоциируются с клеточными
413
мембранами. При обычной электронной микроскопии поверхность вириона нераз-
личима, однако внешний капсид имеет определенную структуру икосаэдральной симметрии и парусообразные («sail» – shaped) поверхностные выступы, которые мо-
гут быть обнаружены на вирионе, сохранившем структуру (например, при исполь-
зовании криоэлектронной микроскопии). При удалении внешнего капсидного слоя можно различить поверхностный слой коровой частицы, который полностью состо-
ит из капсомеров VP7(T13), организованных в виде гексамерных колец(пентамер-
ных – по пятигранным вершинам). Эти кольца, легко различимые с использованием обычной электронной микроскопии, и послужили основой для названия рода. Коро-
вые частицы также содержат полный внутренний капсидный чехол(подкоровый слой), который окружает 10 геномных сегментов dsRNA. Минорные коровые про-
теины (транскриптазный комплекс) прикреплены к внутренней поверхности субкора по пятиосной симметрии. Сборка субкорового слоя определяет конечный размер и симметрию частицы.
Mr (вирион) 108 ´ 106, Mr (кор) 67 ´ 106; плавучая плотность в CsCl 1,36 г/см3
и 1,40 г/см3 (для вириона и кора, соответственно). Инфекционность вирионов ста-
бильна при рН от 8 до 9, но резко снижается при значениях рН, выходящих за рамки от 6,5 до 10,2. Чувствительность внешних капсидных протеинов к воздействию ка-
тионов (например, MgCb, CsCl) зависит от рН среды и штамма. При рН ниже 5,0 ви-
рионы и коры разрушаются. За исключением ортореовирусов, при рН 3,0 инфекци-
онность вируса утрачивается. В пробах крови, сыворотки или альбумина, при тем-
пературе не выше 15 °С, вирус может сохраняться в течение десятилетий. Очищен-
ные вирионы BTV в 0,1 М Tris / HCl рН 8, при температуре 4 °С сохраняют актив-
ность в течение года. Кристаллы коровых частиц очень стабильны при температуре
29 °С. При нагревании до 60 °С инфекционная активность вируса резко падает. В
целом орбивирусы относительно резистентны к воздействию растворителей и детер-
гентов, хотя к отдельным детергентам чувствительность отдельных вирусов может различаться. Додецилсульфат натрия разрушает частицы. Замораживание может приводить к снижению инфекционности вируса на90 % в основном за счет разру-
шения частиц. Однако при однократном замораживании и хранении при минус
414
70 °С инфекционность вируса сохраняется.
Геном. 10 сегментов линейных двуспиральных РНК, имеющих Mr от 0,6 ´ 106
до 2,6 ´ 106. Общая Mr генома MRV-3 около 15 ´ 106 (23549 bр); 12 % и 19,5 % су-
хой массы вириона и кора, соответственно. Геномная РНК упаковывается в виде се-
рий упорядоченных концентрических чехлов внутриVP3(T2) слоя субкора. Четыре слоя РНК, каждый из которых имеет элементы икосаэдральной симметрии, может быть выявлен в кореBTV методом кристаллографии (рентгеновскими лучами).
Внутри центрального пространства субкора молекулыdsRNA ассоциируются с плотной белковой субстанцией по вершинам пятиосной симметрии(вершинам ико-
саэдрона). Геномная РНК содержит 5'-концевую структуру Сар 1.
Размер сегментов генома вируса блютанга варьирует от 822 bp до 3954 bр (об-
щий размер 19,2 kbp, общая Mr 13,1 ´ 106). Короткие олигонуклеотиды внутри зре-
лых вирионов не обнаружены. Геномные РНК обозначаются сегментами1-10 в со-
ответствии с повышением электрофоретической подвижности в1 % агарозном геле и в соответствии со снижением молекулярного веса. Например, для вируса блютанга сегменты подразделены по подвижности на три класса: 3 крупных (от 1 kbp до
3 kbp; от 3,9 kbp до 2,8 kbp), 3 средних (от 4 kbp до 6 kbp; от 2,0 kbp до 1,6 kbp) и 4
малых сегмента (от 6 kbp до 10 kbp; от 1,2 kbp до 0,8 kbp). В сегментах генома, про-
анализированных на данный момент, выявлены только по одной ORF, которые все-
гда на одной и той же цепи. Однако ORF может иметь более одного функционально-
го кодона инициации трансляции по 5'-концу.
Для BTV-10 5'-NTR варьирует от 8 bp до 34 bp, тогда как по 3'-концу они со-
ставляют от 31 bp до 116 bp. У других вирусов данная область также короче по5'-
концу, относительно 3'-конца. У BTV NTRs включают терминальные последова-
тельности в 6 bp, которые идентичны у всех10 сегментов РНК, и консервативны у разных изолятов BTV. Другие орбивирусы имеют похожие сиквенсы, но которые не всегда идентичны и не всегда консервативны для всех 10 сегментов.
Другие компоненты вириона. Определено 7 вирусных структурных протеи-
нов (VP1-7), составляющие 80,5 % сухого веса вириона.
415
РНК-зависимая РНК полимераза внешний слой внешнего капсида, определяет серотип вируса, участвует в прикреплении к клетке, определяет вирулентность, лег-
ко разрезается протеазами. Наиболее вариабельный протеин. Реагирует с нейтрали-
зующими антителами. Тример формирует внутреннюю основу протеинового кап-
сидного чехла, симметрия Т = 2, определяет конечный размер и структуру капсида,
связывает РНК, взаимодействует с минорными внутренними протеинами. Димер,
трансметилаза 1 и 2, кэпирующий энзим (гуанилтрансфераза). В цитоплазме образу-
ет трубочки, функция которых не ясна. Характерно для репликации орбивирусов.
Образует внутренний слой внешнего капсида, гликозилирован, частично определяет серотип вируса, вариабельный, тример.
Тример, образует внешнюю поверхность кора, симметрия Т = 13, у некоторых видов (AHSV) образует гексагональные кристаллы, участвующие в проникновении в клетку и поддержании инфекционности коровой частицы в клетках насекомых-
переносчиков, взаимодействует с антителами, нейтрализующими кор, иммунодоми-
нантны R видоспецифический антиген. Участвует в образовании матрикса телец-
включений, связывает ssRNA, фосфорилирован. Может быть ассоциирован с внеш-
ним капсидом. Связывает ss- и dsRNA, хеликаза, NTPase.
Гликопротеины, мембранные протеины, участвуют в выходе из клетки. У не-
которых видов (AHSV) являются вариабельными протеинами и определяют виру-
лентность.
У BTV внешний капсидный протеин представлен180 копиями; парусооб-
разный протеин VP2, представленный 360 копиями расположен ниже протеина VP5 (Mr 59 ´ 103), который организован в 120 тримеров. VP2 и VP5 соприкасаются с VP7
(Т = 13). Поверхность коровой частицы образована 780 копиями протеина VP7, ко-
торые организованы в сеть гекса- и пентамерных колец. Ниже расположен субкоро-
вый капсидный чехол, образованный 120 копиями протеина VP3, организованного по Т = 2 симметрии. VP3 (Т2) капсидный чехол окружает 10 двуспиральных сегмен-
тов генома и три структурных минорных протеина(VP1 (Pol, Mr 150 ´ 103), являю-
щийся РНК полимеразой; VP4 (Cap, Mr 76 ´ 103), образующий функциональные ди-
416
меры, обладающие активностью гуанилинтрансферазы и трансметилазы1 и транс-
метилазы 2); и VP6/VP6a (Hel, Mr 36 ´ 103), связывающий РНК и обладающий про-
теазной и хеликазной активностью).
Различают 3 неструктурных протеина. Протеин NS1 (TuP, Mr 64 ´ 103) образу-
ет в клетках трубочки разлитой длины(до 4 мкм), функция которых не ясна, но ко-
торые являются характерными при орбивирусных инфекциях. Протеин NS2 (VP, Mr
41 ´ 103) является компонентом матрикса сборки и репликации. Протеины
NS3/NS3a (Mr 25 ´ 103 и 24 ´ 103) участвуют в высвобождении вирусных частиц из клетки.
Организация генома и репликация. Сегменты генома BTV, в соответствии с профилем миграции в 1 %-ной агарозе, обозначаются следующим образом: Сегмент
1-VP1 (Pol); Сегмент 2-VP1; Сегмент 3-VP3 (Т2); Сегмент 4-VP4 (Сар); Сегмент 5- NS1 (TuP); Сегмент 6-VP5; Сегмент 7-VP7 (Т13); Сегмент 8-NS2 (ViP); Сегмент 9- VP6/VP6a (Hel); Сегмент 10-NS3/NS3a. Родственные гены разных штаммовBTV
сходны.
Для адсорбции вируса используются компоненты внешнего капсида, хотя для проникновения в клетку может быть использованVP7(T13). VP2 (вероятно также и
VP5) является определяющим вирулентность. Внешний капсидный слой теряется во время ранних стадий репликации. Транскрипционная частота мРНК отдельных ге-
номных сегментов различна; с меньших сегментов синтезируется больше копий.
Вирусные тельца-включения считаются местом морфогенеза транскрипционно -ак тивных вирусных коров, содержащих dsRNA. Наименьшие частицы, содержащие РНК, обнаруживаемые в тельцах-включениях, представляют собой вновь образо-
ванные субкоровые частицы. Внешний коровый протеинVP7(T13) добавляется в тельца-включения и внешний капсидный протеин. Вирусные частицы транспорти-
руются внутри клетки благодаря специфическому взаимодействию с клеточным ци-
тоскелетом, и могут покидать клетку до ее лизиса за счет взаимодействия с -мем бранно-связанным протеином NS3. Отмечена специфическая ассоциация между трубочками, образованными протеином NS1, и зрелыми вирионами в цитоплазме
417
клетки. В клетках млекопитающих, репликация орбивирусов приводит к выключе-
нию синтеза белков клетки и обычно заканчивается лизисом клетки и высвобожде-
нием вирусных частиц. У персистентно инфицированных клеток насекомых не на-
блюдается отключения синтеза клеточных белков, лизиса или ЦПЭ. У некоторых видов вирусов (AHSV) протеин NS3 определяет вирулентность. Вирусные частицы могут покидать клетку по двум основным путям: экструзией (разрушение мембраны клетки) и почкованием. В клетках Culicoides variipennis (вектора BTV) отмечается только почкование вируса, приводящее к появлению у вирионов мембранной обо-
лочки, которая, однако, нестабильна и быстро теряется. Непрерывное высвобожде-
ние вирусных частиц из инфицированных клеток и реинфекция являются характер-
ным признаком орбивирусной репликации.
Антигенные свойства. Основным вирусным серогрупповым (видоспецифич-
ным) антигеном является иммунодоминантный внешний коровый протеинVP7(13).
Антитела к данному белку обладают нейтрализующей активностью по отношению к коровым частицам, но не для интактного вириона. Другие вирусные протеины также консервативны между видами вирусов(особенно кор и неструктурные протеины).
Однако некоторые белки могут проявлять перекрестную активность с аналогичными белками вирусов других видов(чаще односторонне). Анализ сиквенса РНК консер-
вативных сегментов показал возможность подразделения всех орбивирусов на4 ос-
новные «группы». Первая группа (А) включает AHSV, BTV, EHDV, EEV, EUBV, PALV, WALV и WARV. Вторая группа (В) включает CNUV, IERIV, WMV и GIV.
Третья группа (С) включает CORV. Четвертая группа (D) включает WGRV.
Все виды орбивирусов включают несколько серотипов, которые могут быть идентифицированы в реакции нейтрализации интактных вирусных частиц (в первую очередь, через взаимодействие антител с внешними капсидными протеинами).
Главным антигеном BTV, участвующим в нейтрализации, является протеин VP2.
Протеин VP5 также может быть использован в определении серотипа вируса, веро-
ятно за счет конформационного скрытия протеинаVP2. Оба эти протеина (VP2 и VP5) BTV проявляют очень высокую степень антигенной и сиквенсной вариабель-
ности. У других вирусов (GIV) относительный размер внешних капсидных протеи418
нов (VP4 и VP5) очень различен и их роль также может быть различной. Очевидно,
что VP2 BTV (особенно в ассоциации с VP5) и VP7(T13) могут быть протективными антигенами.
У AHSV мелкие неструктурные протеины NS3 и NS3 также вариабельны и на основе анализа сиквенсов могут быть подразделены на три группы(а, р и у), Пред-
варительные данные свидетельствуют о слабой перекрестной активностиNS3 меж-
ду этими группами. Данный белок может участвовать в определении вирулентности
(AHSV), вероятно в результате своего участия в высвобождении вирусных частиц из клетки (почкование) и последующего дессиминирования вируса.
Биологические особенности. Инфекционность коровых частицBTV может быть в 1000 раз ниже, чем у интактных вирусных частиц, или совсем отсутствовать,
в зависимости от используемой культуры клеток млекопитающих. Однако в некото-
рых клетках насекомых и взрослых насекомых-векторах инфекционность коровых частиц лишь немного ниже, чем у интактных вирионов. Обработка вирионов трип-
сином или химотрипсином приводит к образованию инфекционных субвирусных частиц. Такие субвирусные частицы BTV теряют гемагглютинирующую активность,
так же как и склонность к агрегированию, но значительно повышают инфекцион-
ность по отношению к взрослым насекомым-векторам и некоторым культурам кле-
ток насекомых.
Орбивирусы инфицируют широкий спектр позвоночных, включая жвачных
(домашних и диких), однокопытных (домашних и диких), грызунов, птиц, сумчатых,
летучих мышей, ленивцев, приматов, и человека. Орбивирусы репродуцируются в членистоногих, которые являются основным фактором их распространения (комары,
москиты, клещи, в зависимости от вида вируса). Показана трансстадийная передача у клещей. Может происходить внутриутробное заражение у позвоночных. Орбиви-
русы, переносчиками которых являются членистоногие с коротким жизненным цик-
лом (комары, москиты, мошки), энзоотичны только в районах, где имаго векторов может существовать большую часть года. Нет сведений о трансовариальной переда-
че орбивирусов у Culicoides, хотя они выделялись из культур клеток, приготовлен-
ных из яиц клещей. BTV и EHDV распространены повсеместно между параллелью
419
50° северной широты и параллелью30° южной широты в Америке и между40° се-
верной широты и параллелью 35° южной широты – в остальном мире. Однако оче-
видно, что вирус персистирует в зимний период без признаков болезни у хозяев.
Механизм персистенции у видов позвоночных(естественных хозяев) даже на низ-
ком уровне может иметь важное значение. Распространение вирусов также зависит от первичного заноса в районы, где имеются восприимчивые позвоночные и подхо-
дящие виды переносчиков. По этой причине, не все серотипы каждого вида(напри-
мер, BTV) присутствуют в данной местности, где некоторые серотипы эндемичны.
Инфекция орбивирусов у членистоногих не проявляется или проявляетс очень незаметно. Инфекция у позвоночных может варьировать от инаппарантной до фатальной, в зависимости от вида вируса и животного-хозяина. Некоторые штаммы
BTV вызывают гибель овец, другие – различную патологию, включая геморрагии,
хромоту, отеки живота, кратковременный цианоз языка (что дало название вирусу),
поражения носа и рта и т.п., тогда как другие не вызывают явной патологии. Инфек-
ция, вызванная BTV, у КРС может не проявляться клинически, но сопровождается длительным вирусоносительством. AHSV, EHDV, EEV могут вызывать серьезную патологию у соответствующих естественных хозяев(позвоночных). Уровень смерт-
ности в серологически чистой популяции может превышать 98 % (AHSV).
Критерии подразделения на виды внутри рода. Также как и в отношении представителей других родов семейства, определяющим критерием для классифи-
кации по видам является доказательство способности к реассортации генетических сегментов при коинфекции, с образованием жизнеспособного потомства. Однако на данный момент недостаточно сведений о реассортации между изолятами, и в основе методов диагностики отдельных видов(серогрупп) лежат серологические исследо-
вания (с использованием иммунодоминантного серогруппового (видоспецифичного)
антигена VP7(T13)).
Представители данного рода могут быть идентифицированы на основании следующих признаков:
1 Способность к обмену генетическим материалом путем реассортации сег-
ментов генома во время коинфекции, приводящим к образованию жизнеспособных
420